HMGB1-RAGE信号轴调控肥大细胞活化在炎症中的关键作用及机制研究

本综述深入探讨了HMGB1（高迁移率族蛋白B1）作为关键警报素（alarmin）通过RAGE（晚期糖基化终末产物受体）依赖性信号通路调控肥大细胞（MCs）活化的分子机制。研究揭示了HMGB1通过激活ERK1/2、p38 MAPK、PI3K、NF-κB和JAK2等信号分子，显著增强Dectin-1、RIG-I和NOD1等模式识别受体（PRRs）表达，并促进CCL3、IL-1β、TNF、组胺、半胱氨酰白三烯（cysLTs）和活性氧（ROS）等炎症介质的产生。这些发现为过敏、自身免疫病和慢性炎症等肥大细胞驱动性疾病提供了新的治疗靶点。

　　

背景：受损细胞在细胞损伤后释放内源性分子警报素（alarmin）到细胞外空间。警报素可作为佐剂通过与模式识别受体（PRRs）相互作用指示危险并启动局部无菌性炎症反应，促进组织再生。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是关键警报素，通过晚期糖基化终末产物受体（RAGE）内化，通知邻近细胞稳态受损。鉴于肥大细胞（MCs）在炎症过程中的重要作用以及警报素作为危险指标的关键性质，本研究评估了MCs作为细胞损伤重要传感器的假设。

方法：所有实验均使用从大鼠腹腔新鲜分离的体内分化成熟组织MCs进行。研究了HMGB1激发MCs PRR表达、产生和/或释放一系列介质及迁移的能力。

结果：HMGB1显著增强Dectin-1、RIG-I和NOD1的表达，同时刺激MCs产生CCL3、IL-1β、TNF、cysLTs、组胺和ROS。该蛋白作为MCs的有效趋化因子。对MCs施用RAGE拮抗剂显著减弱介质产生和迁移反应，从而证实该受体参与HMGB1处理细胞的反应。HMGB1激活的MCs细胞内信号传导涉及ERK1/2、p38 MAPK、PI3K、NF-κB，以及部分JAK2。

结论：数据有力支持HMGB1是促进和增强炎症过程中MCs活性的重要内源性警报素的观点。这些见解强调HMGB1作为调节MCs驱动的炎症性疾病（包括过敏、自身免疫疾病和慢性疾病）的潜在治疗靶点。

1 引言

最近的研究提出了"分子多任务"生物分子的概念，这些分子参与与其原始功能不一致的相互作用，从而引发不可预见的细胞反应。这些独特结构被指定为警报素——响应细胞损伤或死亡而释放的小型内源性免疫激活肽或蛋白质。警报素主要在细胞环境中发挥非免疫学作用，包括保护蛋白质免于急性变性和聚集，以及与染色质结合，从而作为转录调节因子发挥作用。根据综合研究，稳态细胞内蛋白质也可以在细胞外环境中发挥非稳态作用，发出危险信号并促进炎症；因此，它们被指定为危险相关分子模式（DAMPs）。在创伤期间，DAMPs可通过与模式识别受体（PRRs）结合作为佐剂，向宿主传递"危险"信号并启动局部炎症反应，促进组织再生。无菌组织损伤后的炎症反应和随后的修复机制可能对多细胞生物的进化适应性与感染微生物引起的炎症具有相当的重要性。虽然无菌免疫反应对于维持生理稳态至关重要，但慢性和长期的炎症可能会干扰细胞过程，造成细胞损伤，并最终导致细胞死亡。

高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是一种进化上古老且普遍存在的核蛋白，存在于大多数细胞类型中，被认为是多功能警报素的第一个成员。HMGB1的功能取决于分子的位置、其结合伴侣和其氧化还原状态。在细胞核内，HMGB1负责组织DNA和核小体，同时调节基因转录。研究表明，损伤后大量HMGB1从细胞核被动释放到细胞外空间。核HMGB1能够易位到细胞质，在炎症小体激活、细胞焦亡和自噬/凋亡平衡调节中发挥作用。HMGB1还涉及最近表征的铜死亡（cuproptosis）形式的细胞死亡，这是由细胞内铜依赖性线粒体应激诱导的。在缺乏HMGB1的铜死亡细胞中，诱导RAGE依赖性促炎细胞因子产生的能力显著受损，表明HMGB1在无菌炎症中作为关键免疫介质发挥作用。HMGB1能够主动分泌和被动释放，提供了在显著细胞应激存在下发出一般警报信号的机制，而不一定意味着细胞损伤。几项研究已确定HMGB1是中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的组成部分，及其与多种分子的相互作用，包括脂多糖（LPS）、白细胞介素-1β（IL-1β）、单链DNA、肽聚糖（PGN）和核小体。随后形成的复合物通过与其各自复合物中的相互作用伴侣受体结合来增强炎症反应。

肥大细胞（MCs）是在所有脊椎动物中发现的一种免疫细胞，在维持组织功能和完整性方面起着关键作用。这些细胞广泛分布在几乎所有组织中，并且特征性地位于上皮细胞、成纤维细胞、血管、淋巴管和神经附近。驻留MCs的特定分布、属性和表型可塑性显著促进各种生物过程的适应性和稳态的维持。它们与许多生理和炎症过程相关，包括器官发育、伤口愈合、血管生成、淋巴管生成、心脏功能和宿主防御机制。此外，MCs在组织修复的每个阶段都发挥着重要作用，从最初的炎症反应延伸到细胞外基质（ECM）的重塑。必须认识到，损伤后，MCs在调节初级止血以有效封闭受损表面方面承担关键作用。这些细胞作为炎症的主要效应器；它们似乎已经进化为能够辨别其环境以启动适当生理反应的细胞传感器，这可能促进修复的炎症，或者相反，限制炎症过程以防止进一步损伤。

鉴于MCs在生理和病理过程中的重要作用，必须识别和表征影响其生物学和功能的内源性因素。关于HMGB1对成熟MCs的影响及其在调节组织内MCs活性中的重要性的可用信息仍然不足。鉴于这些发现，本研究调查了HMGB1是否影响成熟MCs中特定PRRs的表达水平。这些受体包括被归类为C型凝集素受体（CLRs）的Dectin-1和Dectin-2、来自Toll样受体（TLRs）类的TLR2、来自核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NLRs）的NOD1，以及来自视黄酸诱导基因-I样受体（RLRs）的RIG-I。此外，本研究旨在确定HMGB1是否调节这些细胞的炎症反应，这包括细胞因子、趋化因子、活性氧（ROS）、组胺和半胱氨酰白三烯（cysLTs）的产生，以及它们的迁移模式。该研究打算检查RAGE在HMGB1介导的MCs激活中的作用，特别强调信号分子的参与，如磷酸肌醇3-激酶（PI3K）、细胞外信号调节激酶（ERK）1/2、丝裂原活化蛋白激酶p38、核因子κB（NF-κB）和Janus活化激酶（JAK）2。

2 材料与方法

2.1 MCs的分离

研究在平均体重约250克、年龄范围3至4个月的雌性白化Wistar大鼠（Crl: WI; Charles River Laboratories）上进行。动物购自罗兹大学生物与环境保护学院动物舍。实验方案获得罗兹动物实验地方伦理委员会批准（第15/2021号）。尽一切努力减少动物痛苦。所有动物在断头前用异氟烷（BAXTER）麻醉。使用50 mL 1% Hank's平衡盐溶液（HBSS; GIBCO）补充0.015%碳酸氢钠（GIBCO）进行灌洗获得腹腔细胞悬液。经过约90秒的腹部按摩后，从腹腔提取细胞悬液。腹腔细胞悬液在完全Dulbecco改良Eagle培养基（cDMEM）中洗涤两次（150 x g，5分钟，20°C），cDMEM由DMEM（Biowest）补充10%胎牛血清（FCS; GIBCO）、10 μg/mL庆大霉素（GIBCO）和2 mM谷氨酰胺（GIBCO）组成。应用等渗72.5% Percoll（Sigma-Aldrich）密度梯度离心（190 x g，15分钟，20°C）纯化MCs。随后，分离的MCs在cDMEM中离心两次（150 x g，5分钟，20°C）。MCs的分离过程持续约45至50分钟。洗涤后，对MCs进行计数并重悬于适当体积的cDMEM（用于定量RT-PCR、流式细胞术和共聚焦显微镜分析以及迁移实验）或专门为大鼠MCs设计的培养基中，该培养基含有137 mM NaCl（Sigma-Aldrich）、2.7 mM KCl（Sigma-Aldrich）、1 mM MgCl₂（Sigma-Aldrich）、1 mM CaCl₂（Sigma-Aldrich）、10 mM HEPES（Sigma-Aldrich）、5.6 mM葡萄糖（Sigma-Aldrich）和1 mg/mL牛血清 albumin（BSA; Sigma-Aldrich）（用于组胺释放实验、ELISA实验和ROS生成），以达到1.5 × 10⁶ cells/mL的MCs浓度。使用适当数量的动物以达到特定的MCs密度和特定类型实验所需的样本数量。MCs的纯度超过98%，通过甲苯胺蓝（Sigma-Aldrich）的异染性染色测量。MCs的存活率大于98%，通过台盼蓝（Sigma-Aldrich）排除试验确定。处理样品的结果与各自实验范围内的对照样品进行比较。

2.2 定量RT-PCR

采用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）评估MCs中受体的组成型和HMGB1诱导的mRNA水平以及细胞因子/趋化因子。纯化的MCs悬浮在cDMEM中，用终浓度为1 μg/mL的HMGB1（Novus Biologicals）在37°C、5% CO₂的湿润气氛中刺激2小时。对于对照组，MCs在相同条件下不加HMGB1维持。使用RNeasy^? Mini Kit（Qiagen）从细胞中提取总RNA。随后，根据iScript cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad Laboratories）的制造商协议合成互补DNA（cDNA）。使用CFX96 Touch?实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories）和iTaq? Universal SYBR^? Green Supermix（Bio-Rad Laboratories）进行qRT-PCR。PCR反应体积包括5 μL iTaq? Universal SYBR^? Green Supermix、1 μL cDNA、2 μL引物（500 nM）和2 μL试剂盒提供的PCR级水。循环条件设定如下：95°C初始变性3分钟，随后进行40个循环，包括95°C变性10秒、60°C退火10秒和72°C延伸20秒。使用Bio-Rad CFX Maestro Software通过ΔΔCt方法计算测试样品的倍数变化。受体和细胞因子/趋化因子mRNA的表达水平根据看家基因大鼠Actb的转录水平进行标准化。未刺激的样本用作校准样品。引物序列在表1中描述。

2.3 用于流式细胞术和共聚焦显微镜分析的细胞制备

通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估HMGB1诱导的Dectin-1、Dectin-2、TLR2、NOD1和RIG-I的表达水平及其组成型表达。在未刺激的MCs中分析了Dectin-1、Dectin-2、TLR2、NOD1和RIG-I的组成型表达。在37°C、5% CO₂的湿润气氛中，用终浓度为10 ng/mL的HMGB1孵育1或3小时的MCs中评估诱导的受体表达。为了确定受体的细胞内定位，将MCs用CellFIX?（BD Bioscience）溶液在4°C固定15分钟，随后用1 × PBS（Cayman Chemical）洗涤两次。此后，将MCs用0.1%皂苷（Sigma-Aldrich）在室温下透化30分钟。然后将MCs重悬于1 × PBS中，并用山羊抗Dectin-1、山羊抗Dectin-2（Invivogen）、兔抗TLR2、山羊抗NOD1或山羊抗RIG-I抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）以1:100稀释度染色1小时。对于对照，MCs用具有无关特异性的山羊或兔IgG同种型对照（R&D Systems）染色。从样品中省略一抗以确认二抗的非特异性结合。随后，用1 × PBS洗涤细胞，并与Alexa Fluor 488^?兔抗山羊IgG或Alexa Fluor 488^?山羊抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.）以1:100稀释度在1 × PBS中在黑暗中孵育1小时。为了确定受体的表面定位，将MCs用CellFIX?（BD Bioscience）溶液在4°C固定15分钟，并用1 × PBS（Cayman Chemical）洗涤两次。在此程序之后，在受体评估之前，将细胞洗涤两次并最终重悬于1 × PBS中。每次孵育期后，使用台盼蓝排除试验评估MCs的存活率。

2.4 流式细胞术

使用配备BD CellQuest?软件（BD Biosciences）的BD FACSCalibur?流式细胞仪分析每个样品的一万个事件。HMGB1依赖性MCs Dectin-1、Dectin-2、TLR2、NOD1和RIG-I的表达表示为Dectin-1/Dectin-2/TLR2/NOD1/RIG-I的平均荧光强度（MFI）百分比，在未刺激的MCs中测量，称为100%。

2.5 共聚焦显微镜

将样品固定在显微镜载玻片上，并使用配备HC PL APO CS2 63x/1.4油镜的Leica TCS SP8显微镜（Wetzlar, Germany）在罗兹大学显微成像和 specialized 生物技术实验室获取图像。使用488 nm激光激发荧光，并通过混合检测器在505–550 nm范围内收集发射。为了便于细胞可视化，使用了PMT透射通道。使用LAS X 2.0.2.15022软件（Leica Microsystems）进行数据分析。所有设置在实验过程中保持一致。通过剖面视图图像分析以及位于每个显微照片下方的强度值图表验证所有来自共聚焦显微镜的信号。计算每个样品的平均荧光强度（以任意单位表示，A.U.）。对显示受体表达的区室中随机选择的至少40个不同点进行计算。

2.6 ELISA

为了测量细胞因子和趋化因子的生成，将悬浮于大鼠MCs专用培养基中的纯化MCs与终浓度为0.1、1和10 μg/mL的HMGB1或单独缓冲液（用于评估自发性细胞因子和趋化因子生成）在37°C、5% CO₂的湿润环境中孵育3小时。随后，通过离心收集上清液。使用ELISA试剂盒测定上清液中TNF、TGF-β、IL-1β、CCL3、CCL4和cysLTs的浓度——具体而言，TNF和IL-1β来自Wuhan Eiaab Science Inc.；TGF-β、CCL3和CCL4来自Biorbyt Ltd.；cysLTs来自Cayman Chemical——按照制造商的说明进行。这些测定的灵敏度分别确定为< 7 pg/mL、< 6 pg/mL、< 14 pg/mL、< 1 pg/mL、< 15 pg/mL和< 20 pg/mL。

2.7 组胺释放实验

将悬浮于大鼠MCs专用培养基中的纯化MCs与终浓度为0.1、1和10 μg/mL的HMGB1，以及化合物48/80（Sigma-Aldrich）（一种公认的有效MCs脱颗粒因子），终浓度为5 μg/mL（阳性对照）或单独缓冲液（自发性组胺释放）在水浴中37°C连续搅拌孵育30分钟。孵育期后，通过加入1.9 mL冷培养基终止反应。随后，对细胞悬液进行离心，并将上清液转移到单独的管中。向每个含有细胞沉淀的管中加入2 mL蒸馏水。使用先前详细描述的光谱荧光法量化细胞沉淀（残留组胺）和上清液（释放的组胺）中的组胺含量。组胺释放表示为胺的总细胞含量的百分比。

2.8 迁移实验

使用Boyden微室测定（Neuro Probe）在48孔趋化室（Neuro Probe）中研究MCs对HMGB1的迁移反应。将30微升终浓度为0.1、1和10 μg/mL的HMGB1或单独缓冲液（自发性迁移对照）放入微室的下室。这些下室然后用具有8 μm孔径的聚碳酸酯膜覆盖，并将50 μL细胞悬液引入上室。随后，将趋化室在37°C、5% CO₂的湿润气氛中孵育3小时。孵育期后，通过用橡胶刀轻轻刮擦去除粘附在膜上表面的MCs。粘附在膜下表面的迁移细胞用99.8%乙醇（Avantor Performance Materials, Poland）固定，用苏木精（Sigma-Aldrich）染色10分钟，在蒸馏水中清洗，然后安装在显微镜载玻片上。通过计数穿过膜并粘附在过滤器底面的细胞数量来量化MCs迁移。每个测定评估十个高倍视野（HPF）（x 250）。自发性迁移作为对照并被指定为100%。结果表示为对照迁移的百分比。

2.9 细胞内ROS产生的测量

为了确定活性氧（ROS）的产生，将悬浮于大鼠MCs专用培养基中的MCs与终浓度为0.1、1和10 μg/mL的HMGB1或单独培养基在37°C、5% CO₂的湿润气氛中孵育1小时。随后，加入终浓度为5 μM的CellROX? Green Reagent（Invitrogen）并与细胞在37°C再孵育30分钟。然后用1 × PBS洗涤细胞三次，随后使用FLUOstar Omega微孔板阅读器（BMG Labtech）进行分析。在485/520 nm的激发和发射波长下评估荧光强度。ROS生成被量化并表示为平均信号强度（MSI）。

2.10 RAGE受体参与

为了确定HMGB1受体的作用，使用了RAGE拮抗剂FPS-ZM1（R&D Systems）。纯化的MCs在进行主要程序（包括用于蛋白质测量的ELISA、组胺释放实验、细胞内ROS产生测量试剂盒和迁移实验）之前，用拮抗剂在37°C水浴中连续搅拌预处理15分钟。FPS-ZM1的使用浓度为5 μM。根据初步实验按照制造商指南选择拮抗剂的浓度。

2.11 MCs用信号通路抑制剂处理

为了分析细胞信号通路，纯化的MCs在开始主要程序之前，用各种信号分子抑制剂或单独培养基在37°C预处理1小时。ERK1/2抑制剂PD98059（Sigma-Aldrich）以50 μM浓度施用，p38抑制剂SB203580（Sigma-Aldrich）以10 μM浓度施用，PI3K抑制剂LY294002（Sigma-Aldrich）以50 μM浓度施用，JAK2抑制剂AG490（Merck Millipore）以10 μM浓度使用。MCs还与3 μM的NF-κB抑制剂MG-132（InvivoGen）在37°C预孵育15分钟。所有应用的抑制剂的浓度在初步实验中根据制造商的说明确定。所有抑制剂均未损害MCs存活率，通过台盼蓝排除试验确认。孵育后，将MCs在1 × PBS中洗涤两次，重悬于适当的培养基中，并用于如前所述的组胺释放实验、迁移实验和细胞内ROS产生测量。

2.12 统计分析

使用Statistica 13软件（Statsoft Inc., USA）对实验数据进行统计分析。数据表示为平均值±标准差（SD）。使用Shapiro-Wilk检验评估分布的正态性。使用Student's t检验和单因素ANOVA followed by post hoc Tukey's检验评估显著差异，P值< 0.05被视为具有统计学意义。调整后的P值在补充数据表S1–S3中呈现。

3 结果

3.1 HMGB1对MCs中Dectin-1、Dectin-2、TLR2、NOD1和RIG-I表达的影响

最初，研究了HMGB1调节MCs上PRRs表达的能力。采用qRT-PCR技术测定未刺激MCs与HMGB1刺激的MCs中Dectin-1、Dectin-2和TLR2的mRNA表达水平。如图1A所示，HMGB1导致Dectin-1 mRNA表达上调1.3倍（P < 0.05），但不影响Dectin-2和TLR2的mRNA水平。随后，我们利用流式细胞术和共聚焦显微镜探讨了HMGB1是否影响所选表面PRRs的基线表达水平。在未刺激的MCs和暴露于HMGB1（10 ng/mL）1小时或3小时的MCs中评估受体表达。我们观察到，与HMGB1孵育1小时和3小时后，Dectin-1的基线表达水平显著（P < 0.05）上调，分别达到对照Dectin-1表达的138.84 ± 13.42%和140.56 ± 10.81%（图1B, C）。共聚焦和荧光强度成像表明，细胞表面Dectin-1信号在孵育1小时后达到峰值131.41 ± 5.81任意单位（A.U.）（P < 0.05），孵育3小时后达到133.15 ± 11.23 A.U.（P < 0.05）（图1D）。我们也通过单因素ANOVA确定了统计学显著差异（P < 0.0001）。此外，流式细胞术和共聚焦显微镜验证了Dectin-2和TLR2在未刺激（NS）MCs表面的存在，显示刺激HMGB1后表达水平没有显著改变。

图1：MCs中组成型和HMGB1诱导的Dectin-1/Dectin-2/TLR2 mRNA和蛋白质表达。细胞与单独培养基（未刺激MCs；NS）或10 ng/mL HMGB1孵育，并通过（A）qRT-PCR、（B, C）流式细胞术和（D）共聚焦显微镜评估受体表达。（B）代表性流式细胞术直方图显示在非透化细胞中HMGB1刺激后Dectin-1、Dectin-2和TLR2的表达。阴影轨迹——同种型对照，开放轨迹——未刺激MCs（绿色）和HMGB1刺激1小时（紫色）和3小时（蓝色）后的受体表达。（C）组成型受体表达作为对照并被指定为100%。结果表示为组成型受体表达的百分比。结果是三次重复实验的平均荧光强度±SD。差异在P < 0.05时被认为是显著的，并在每个图上用星号（）标记（Student's t检验），P< 0.05。（D）通过共聚焦显微镜分析显示在非透化未刺激（NS）和HMGB1刺激的MCs中Dectin-1/Dectin-2/TLR2表面定位的代表性图像。

MCs中细胞内PRRs——NOD1和RIG-I的表达如图2所示。HMGB1强烈影响NOD1（P < 0.001）和RIG-I（P < 0.001）mRNA表达（图2A）。HMGB1诱导细胞内NOD1蛋白水平增强，信号强度在1小时后达到对照受体表达的134.78 ± 1.30%（P < 0.05），3小时后达到138.98 ± 2.42%（P < 0.01）（图2B, C）。使用免疫细胞化学染色，我们可视化地观察到NOD1主要存在于核区（图2D）。图像分析显示，与该分子孵育后受体表达上调（NS: 33.86 ± 6.56; HMGB1: 1h - 70.72 ± 15.17 A.U., 3h - 94.99 ± 15.57 A.U.），这通过单因素ANOVA（P = 0.0026）得到证实。信号与位于细胞核附近的细胞质密切相关。

图2：MCs中组成型和HMGB1诱导的NOD1和RIG-I mRNA和蛋白质表达。细胞与单独培养基（未刺激MCs；NS）或10 ng/mL HMGB1孵育，并通过（A）qRT-PCR、（B, C）流式细胞术和（D）共聚焦显微镜评估受体表达。（B）代表性流式细胞术直方图显示在透化细胞中HMGB1刺激后NOD1和RIG-I的表达。阴影轨迹——同种型对照，开放轨迹——未刺激细胞（绿色）和HMGB1刺激1小时（紫色）和3小时（蓝色）后的受体表达。（C）组成型受体表达作为对照并被指定为100%。结果表示为组成型受体表达的百分比。结果是三次重复实验的平均荧光强度±SD。差异在P < 0.05时被认为是显著的，并在每个图上用星号（）标记（Student's t检验），P< 0.05, P < 0.01, P* < 0.001。（D）通过共聚焦显微镜分析显示在透化未刺激（NS）和HMGB1刺激的MCs中NOD1/RIG-I细胞定位的代表性图像。

MCs与HMGB1孵育1小时导致细胞内RIG-I水平与未刺激MCs对照组相比统计学显著增加，P值小于0.05（图2B, C）。延长孵育进一步增强了受体的表达，达到基线水平的156.95 ± 26.17%，p值小于0.001。用HMGB1刺激MCs导致RIG-I表达增加，这通过伴随每个显微照片的强度图得到证明（NS: 23.17 ± 4.88; HMGB1: 1 h - 117.67 ± 11.30 A.U., 3 h - 200.34 ± 17.40 A.U.）（参见图2D）。我们还发现了统计学显著差异，如单因素ANOVA所确定（P < 0.0001）。在细胞内区域和细胞表面下方注意到信号的显著富集。

3.2 HMGB1对MCs促炎反应的影响

随后，为了确定HMGB1是否能够引发MCs的炎症和免疫调节反应，我们评估了该因子影响趋化因子/细胞因子mRNA表达的能力。进行了qRT-PCR，并评估了HMGB1刺激（10 ng/mL）MCs与未刺激细胞相比细胞因子/趋化因子mRNA表达的倍数变化。如图3A所示，在HMGB1刺激的MCs中分析的趋化因子/细胞因子中，mRNA表达水平最高的是TNF（增加9.8倍）、IL-1β（增加6.5倍）（P < 0.001）、TGF-β（6.2倍变化）、CCL3（4.4倍变化）、IL-18（3.8倍变化）（P < 0.01）、CCL4（3.5倍变化）和CCL5（2.9倍变化）（P < 0.05）。在后续阶段，我们研究了显示最大mRNA水平增加的一种趋化因子和两种细胞因子的蛋白质合成。为此，用浓度范围从0.1到10 ng/mL的HMGB1刺激MCs 3小时，使用单独培养基作为阴性对照，抗IgE作为阳性对照。此外，我们的目标是阐明RAGE在HMGB1激活MCs中的作用。这些实验的结果呈现在图3B–D中。在最