极端微生物Pseudomonas alcaliphila维生素B12的功能特性及其微生物底盘潜力评估

本综述系统评估了极端微生物Ectopseudomonas alcaliphila MSJ19（EaM）合成维生素B12（B12）的生物活性及工业应用潜力。研究通过微生物学检测（Microbiological assay）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、体外酶活性分析（GD/DD assay）、分子对接（Molecular docking）及体内3-羟基丙酸（3-HP）生物合成途径验证，证实EaM主要产生活性形式腺苷钴胺素（AdoCbl）。该研究为B12生物活性评估提供了多维度技术框架，并凸显了极端微生物作为高效微生物底盘（Microbial chassis）在合成高附加值化学品中的战略价值。

　　

维生素B₁₂（B₁₂）是一种含钴的四吡咯辅因子，在大多数生物体的关键代谢过程中发挥重要作用，但仅有部分细菌能够从头合成（de novo synthesis）。其常见活性形式包括腺苷钴胺素（AdoCbl）、甲基钴胺素（MeCbl）以及稳定性较高的合成形式氰钴胺素（CNCbl）。本研究聚焦于一株极端微生物——Ectopseudomonas alcaliphila MSJ19（EaM），系统评估其B₁₂生产能力及各形式的生物活性。

在方法上，研究首先通过微生物学检测法和液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对EaM提取物中的B₁₂进行定性与定量分析，确认天然B₁₂形式的存在。进一步采用体外酶活性实验，以甘油脱水酶（Glycerol Dehydratase, GD）和二醇脱水酶（Diol Dehydratase, DD）为模型，评估不同B₁₂形式对其活性的影响。此外，还运用计算模拟方法（分子对接，Molecular Docking）研究各B₁₂形式与GD和DD的结合模式。在体内层面，通过在大肠杆菌E. coli W和EaM中引入依赖辅酶B₁₂的3-羟基丙酸（3-HP）生物合成途径，评估其在无外源B₁₂条件下将甘油转化为3-HP的能力。

研究结果显示，EaM在摇瓶培养中可产生约7 μg/g细胞干重的B₁₂。LC-MS分析表明，其提取物中主要存在天然形式的B₁₂（AdoCbl和MeCbl），而未检出CNCbl。酶活性实验表明，GD和DD的活性高度依赖AdoCbl，其活性等级为AdoCbl > MeCbl > CNCbl，且在低至0.35 nM的粗提物浓度下仍可检测到显著活性。分子对接结果进一步从结构上解释了这一差异：AdoCbl能以较高亲和力与酶的活性位点结合，并支持钴-碳键（Co-C bond）均裂产生5′-脱氧腺苷自由基，这是催化作用的关键；而CNCbl和MeCbl虽可结合，但因缺乏该活性基团，反而表现出竞争性抑制。

在体内实验中，表达GD的E. coli W在添加500 nM AdoCbl时3-HP产量最高（50.2 mM），而粗提物在0.35 nM时仍可支持5.9 mM的3-HP生成，与AdoCbl的效果高度接近（7.8 mM）。值得注意的是，即使添加CNCbl或MeCbl，重组菌仍能产生一定量的3-HP，推测宿主细胞内可能存在B₁₂转化机制，可将非活性形式转化为AdoCbl，但效率较低。最令人瞩目的是，重组EaM菌株（EaM_r）在无外源B₁₂的条件下仍可合成3.2 mM的3-HP，充分证明其具备内源性合成、加工并利用活性B₁₂的能力。

综上所述，本研究通过整合体外酶学、计算模拟和体内代谢途径验证，建立了一套评估B₁₂生物活性的多功能技术框架。它不仅证实EaM作为极端微生物底盘在可持续生产高附加值化学品方面的潜力，也为未来开发基于生物学输出的B₁₂高通量定量方法奠定基础。此外，该研究首次报道了在非模式嗜碱微生物中实现无外源B₁₂的3-HP生产，为工业生物技术提供了新的可能。