ATG16L1基因rs2241880（T300A）变异通过结构稳定性改变调控克罗恩病易感性的分子机制与功能研究

本研究首次整合多组学分析（GWAS/TWAS）、人工智能预测（AlphaFold3/ThermoMPNN）、分子动力学模拟与实验验证（TSA/pull-down），揭示ATG16L1基因T300A突变通过增强蛋白刚性（RMSD↓/RG↓/SASA↓）和热稳定性（Tm↑），反而破坏WD40域功能与WIPI2b结合能力，为克罗恩病（CD）的精准医疗提供新靶点。

　　

引言

人工智能（AI）技术的快速发展正在深刻重塑生命科学的研究范式。深度学习与机器学习模型已成为该领域的核心工具，尤其在蛋白质结构预测、基因组学分析和药物开发等关键领域展现出深远影响。在蛋白质研究领域，AI模型取得了里程碑式进展：随着AlphaFold等模型的突破，长期困扰学界的蛋白质折叠问题已得到实质性解决；蛋白质三维结构预测和突变功能分析的准确性大幅提升。

ATG16L1（自噬相关16样蛋白1）是自噬通路中的核心调控蛋白之一，参与自噬体的形成，在清除细胞内病原体和维持肠上皮屏障稳态中起关键作用。其功能与克罗恩病（CD）易感性密切相关。研究表明，其在潘氏细胞和肠上皮细胞中的表达缺陷会显著加剧肠道炎症。ATG16L1的第300位点（rs2241880）是CD研究中的一个关键突变位点，导致错义突变。该突变被认为可能影响ATG16L1蛋白的稳定性，削弱其与伴侣蛋白的结合，进而损害自噬体形成能力。

然而，尽管对ATG16L1与CD关系的研究广泛，关于ATG16L1第300位点突变如何具体影响蛋白质结构与功能的机制分析仍不充分。当前研究主要集中于基因型与表型的关系，尤其是通过表型分析和遗传关联研究揭示突变与CD的联系。但在突变如何影响ATG16L1蛋白稳定性，特别是在蛋白质三维结构、折叠动力学和功能改变方面的探索仍显不足，缺乏详细的机制分析。因此，深入研究ATG16L1第300位点突变并揭示其在蛋白质稳定性和功能丧失中的分子机制至关重要。随着AI技术的引入，特别是AlphaFold3和ThermoMPNN等模型，我们现在拥有了新的研究工具。通过整合这些AI工具，可以深入探究ATG16L1第300位点突变对蛋白质结构的分子水平影响，并进一步揭示其在CD中的潜在机制。热位移 assay（TSA）和 pull-down assay 可进一步验证计算结果。

材料与方法

GWAS分析

CD的GWAS数据来源于IEU数据库（ieu-a-30）的摘要数据，包括5,956名CD患者。对照组由14,927名欧洲血统的健康个体组成，在年龄、性别和地理位置上与病例组匹配，涵盖男性和女性。

MAGMA通过整合多个单核苷酸多态性（SNP）的效应（±10 kb）来评估一个基因或基因组区域的整体影响，而不是单独考虑每个SNP的效应。该软件使用1000 Genomes欧洲phase 3 LD数据。在此基础上，基于MAGMA的基因集分析用于分析与CD致病原因相关的通路。MAGMA将多个SNP的效应汇总到基因水平，在获得每个基因的效应估计后，将这些基因组织成预定义的基因集，同时计算每个基因集的整体效应大小。从https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb数据库获取KEGG、BioCarta和Reactome的通路。

通过基因注释和TWAS识别风险基因，使用UTMOST和FUSION。研究整合了GTExV8 eQTL（49种组织）和CD GWAS数据，以探索组织特异性遗传变异。UTMOST执行单组织TWAS，随后使用多变量模型进行跨组织分析，该模型考虑了组织特异性eQTL效应。FUSION使用GTExV8全血eQTL和CD GWAS数据，构建具有500 kb顺式窗口的惩罚线性模型以验证发现。两项分析均应用Benjamini-Hochberg校正，定义错误发现率（FDR）< 0.05为显著性。

TWAS信号的条件和联合分析（FDR调整后）识别了染色体关键SNP。使用CD GWAS摘要统计和1000 Genomes欧洲LD参考，分析通过条件模型移除TWAS信号，重新应用FDR校正，选择P_FDR < 0.05的SNP，并评估优化后的组合效应。

FOCUS使用摘要统计、eQTL权重和连锁不平衡对CD GWAS数据进行风险区域的精细定位。它评估基因集在TWAS信号和基因组风险中的作用。使用GTExV8权重，后验包含概率（PIP）≥ 0.8且p < 5×10^?8的基因被定义为显著基因。

通过交叉基因注释、跨组织TWAS、单组织TWAS和精细定位分析的风险基因来识别关键基因，随后进行共定位分析。使用“coloc” R包进行共定位分析，以评估GWAS和eQTL信号在因果变异位点的重叠。

动物实验验证

实验动物饲养于河北省中医院，经伦理委员会批准（IACUC-HPHCM-2024037）。使用TNBS（Sigma-Aldrich）诱导结肠炎。将5% TNBS溶液与无水乙醇按1:1体积比混合，制备含2.5 mg/mL TNBS的50%乙醇溶液。以大鼠100 mg/kg体重的剂量在距肛门8 cm近端进行灌肠，并保持头低体位约30秒，以确保混合物到达整个结肠。对照组：用等体积的50%乙醇灌肠。建模周期为7天。

按照RNA提取试剂盒的说明书从大鼠结肠组织中提取总RNA。然后使用逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA。按照反应条件进行，在荧光定量PCR仪上完成总共40个循环。使用β-actin作为内参，采用2^?ΔΔCt方法分析mRNA表达。

将大鼠结肠组织剪碎，按照蛋白质提取试剂盒的说明书测量蛋白质含量。将蛋白质样品煮沸5分钟变性，转移至膜上，然后在摇床上用5%脱脂牛奶封闭2小时。将膜与ATG16L1一抗（1:800）在4°C下孵育过夜。用TBST洗涤四次后，加入二抗（1:8,000），在室温下孵育1.5小时，再用TBST洗涤四次。将膜置于曝光盒中并在暗室中曝光。显影、定影和扫描图像后，分析每组蛋白质条带的亮度值。计算校正后的蛋白质条带亮度值（每个样品的蛋白质条带亮度值与内参条带β-actin亮度值的比值）。以对照组作为标准化标准。

AI建模与预测分析

本研究分析了ATG16L1中的rs2241880突变。该基因已被多项研究证实与CD密切相关。为阐明突变对ATG16L1蛋白质序列的具体影响，使用NCBI Gene和Ensembl数据库查询详细的基因注释。采用先前的策略，在ATG16L1上查询rs2241880错义突变，并使用Ensembl数据库进行进一步的位点搜索。主要关注错义突变引起的氨基酸变化。

为进行后续建模和模拟，需要获取野生型ATG16L1蛋白的结构和氨基酸序列。为此，访问GeneCards和UniProt数据库以收集ATG16L1的详细信息和相关数据。

首先通过GeneCards数据库查询ATG16L1基因的详细信息。从查询中获得了ATG16L1的UniProt ID：Q676U5。

接下来，根据获得的UniProt ID并选择物种为人，通过UniProt数据库搜索并下载ATG16L1的完整氨基酸序列。在UniProt中，发现该蛋白的结构是公开的，可以直接下载。

选择使用AlphaFold3进行突变体的蛋白质结构建模。AlphaFold3利用增强的深度学习模型，结合氨基酸序列、进化信息和物理化学知识，以高精度预测蛋白质的三维结构。与传统实验方法（如X射线晶体学和核磁共振）相比，AlphaFold3提供更快且更准确的预测，尤其是在处理复杂蛋白质突变时，能更好地模拟突变对蛋白质结构的影响。

将ATG16L1突变体的氨基酸序列提交至AlphaFold3在线平台。提交后，AlphaFold3自动预测结构并生成蛋白质的3D模型。下载CIF（晶体学信息文件）并使用PyMOL 3.2教育版将文件转换为PDB（蛋白质数据库）格式。

获得野生型和突变型ATG16L1蛋白的3D结构后，使用GROMACS 2024.5进行分子动力学模拟，以模拟ATG16L1蛋白在溶液中的动态行为和稳定性。本研究分子动力学模拟的具体步骤如下：

使用GROMACS 2024.5进行分子动力学模拟。GROMACS的并行计算能力使其非常适合高效处理大规模生物分子模拟。模拟在Ubuntu 24.04 LTS操作系统上运行。

模拟参数设置：力场和水模型：选择AMBER14SB力场用于ATG16L1的参数化。AMBER14SB力场常用于蛋白质模拟，能准确描述蛋白质中氨基酸残基间的相互作用。溶剂模型：选择TIP3P水模型，这是一种经典的水分子模型，适用于描述生物分子溶液中水分子的行为。系统构建和溶剂化：使用pdb2gmx工具生成蛋白质拓扑文件，使用editconf工具将蛋白质置于立方体盒子中，盒子与蛋白质的最小距离设置为1.0 nm。然后使用solvate命令进行溶剂化，确保水分子均匀分布并填充间隙。电离：使用genion工具添加Na⁺和Cl^?离子，以确保系统的电中性并模拟生理条件下的离子浓度（0.15 M NaCl）。能量最小化和平衡：使用最陡下降算法进行1000步能量最小化，最大步长设置为0.01 nm，以消除系统中的不合理接触和结构。平衡过程：系统首先在恒温恒容条件下平衡100 ps，随后在恒温恒压条件下平衡100 ps以确保系统稳定性。突变体蛋白动力学模拟：平衡后，在恒温恒压条件下（温度300 K，压力1.0 atm）进行100 ns的生产分子动力学模拟，时间步长为2 fs，并使用SHAKE算法约束所有含氢键的键长。模拟生成的轨迹文件用于后续分析和可视化。上述模拟过程进行了三次，最终结果代表三次重复的平均值。

为进一步研究野生型ATG16L1的热稳定性，特别是氨基酸突变对蛋白质功能和稳定性的影响，使用热力学突变选择神经网络（ThermoMPNN）进行热稳定性预测。ThermoMPNN是一种基于图神经网络（GNN）和迁移学习的深度学习模型，专门用于预测蛋白质点突变引起的稳定性变化。具体而言，ThermoMPNN通过输入蛋白质的氨基酸序列和突变信息，预测突变蛋白在高温下的稳定性和结构变化，为后续体内模拟后恢复或增强蛋白质稳定性和功能提供参考。

为高效运行ThermoMPNN模型，通过Google Colab环境进行模型训练和预测。在Google Colab环境中设置ThermoMPNN的运行环境。通过选择合适的库和依赖项，并加载必要的模型和数据集，确保热稳定性预测的顺利进行。由于Colab环境提供GPU支持，这对于运行需要大量计算的深度学习模型（如ThermoMPNN）至关重要，显著加快了训练和预测过程。

在Colab中设置好ThermoMPNN运行环境后，将野生型ATG16L1的PDB文件上传到Colab系统。上传文件后，使用Colab中ThermoMPNN的默认参数运行模型，以执行突变后的蛋白质热稳定性分析。在此过程中，模型使用PyTorch框架中的默认参数对氨基酸突变进行建模，计算突变后蛋白质在不同温度下的稳定性和熔点变化。

蛋白质纯化

将野生型和突变型ATG16L1质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞，铺板，并在37°C下培养过夜。挑选单菌落并在LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.6–0.8。加入IPTG至终浓度0.5 mM，在37°C诱导4小时，收获细胞并通过SDS-PAGE和Western blot进行分析。进一步用0.2 mM和1 mM IPTG在37°C和15°C分别诱导4小时和16小时。离心细胞，裂解（Tris-NaCl缓冲液），并取样进行表达和可溶性评估。将最佳条件扩大至2 L培养，在15°C诱导16小时，随后离心、重悬和超声处理。将沉淀在变性缓冲液中溶解，离心，上清液通过Ni–NTA亲和色谱纯化，使用PBS-尿素（pH 7.4）含50 mM和500 mM咪唑进行洗涤和洗脱。通过SDS-PAGE分析纯化产物。最后，在复性缓冲液（PBS, 300 mM NaCl, 10%甘油, pH 7.4）中复性和浓缩蛋白质。

TSA

使用SYPRO Orange染料进行TSA。反应混合物由5 μL DSF缓冲液和15 μL蛋白质样品组成，在25°C孵育15分钟。随后，加入5 μL SYPRO Orange染料，并在以下条件下执行熔解曲线程序：25°C保持1分钟，随后以0.04°C/s的速率连续升温至95°C，并实时采集荧光，最后在95°C保持15秒。

Pull-down assay

将纯化的His-ATG16L1蛋白（野生型或突变型）首先与Ni-NTA琼脂糖珠在4°C孵育1小时。用结合缓冲液（20 mM Tris–HCl, 100 mM NaCl, 10%甘油, 0.1% NP-40, 10 mM咪唑, pH 8.0）洗涤三次后，将珠子与预先制备的过表达FLAG-WIPI2b的HEK293T细胞裂解液（裂解缓冲液：50 mM Tris–HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 蛋白酶抑制剂混合物, pH 7.4）混合，并在4°C孵育2小时。然后用洗涤缓冲液（20 mM咪唑，其他成分与结合缓冲液相同）洗涤珠子三次。最后，通过SDS-PAGE分离结合蛋白，并使用抗FLAG抗体（1:5,000）和抗His抗体（1:4,000）通过Western blot检测。

结果

GWAS分析结果

使用MAGMA对与CD发病高度相关的风险基因进行注释。经过Benjamini-Hochberg校正（p < 0.05）后，确定了465个显著基因。曼哈顿图突出了每条染色体上最突出的风险基因，不包括性染色体。经过组织特异性富集的Benjamini-Hochberg校正后，四种组织——全血、肺、回肠末端和小肠末端以及脾脏——达到了显著性阈值（p < 0.05）。MAGMA还确定了350个富集的基因集（P_FDR < 0.05），其中前50条通路与IBD、炎症和免疫相关——这与已知的CD机制一致，验证了MAGMA的准确性。

使用UTMOST进行跨组织分析，经过Benjamini-Hochberg校正（p < 0.05）后，28个基因保留了显著信号。在单组织内部验证中，在GTExv8数据集的基因型数据中建模的、在全血中具有显著遗传表达的8,799个基因中，有204个在Benjamini-Hochberg校正后（p < 0.05）表现出显著的TWAS关联信号。曼哈顿图显示了除性染色体外每条染色体上最突出的基因。总之，跨组织和单组织分析确定了四个重叠的候选基因。

进行条件联合分析以评估本研究中识别的位点的条件独立性。有四个位点，即四个基因RP11-973H7.1、PLCL1、ATG16L1和RPL9所在的基因位点（p < 0.05），它们代表了多个重要基因的独立信号。我们注意到，某些GWAS信号受到遗传调控的基因表达的影响。ATG16L1主要贡献了2q37.1位点的信号；然而，以其预测表达为条件后，显著减弱了该区域的TWAS信号。

使用FOCUS软件对欧洲血统人群的数据进行TWAS关联的详细分析。在P_FDR < 0.05和PIP > 0.8的标准下，从全血组织中识别出30个阳性基因。FOCUS成功创建了描绘每个区域预测表达相关性的图。展示了ATG16L1的TWAS摘要统计和PIP。

随后，对通过基因注释、跨组织TWAS、单组织TWAS和精细定位分析识别的显著基因进行交叉。ATG16L1是四种方法共享的风险基因。随后进行共定位分析。共定位分析窗口配置为500 kb，得到PPH4结果为0.889。

动物实验结果

在大鼠结肠组织中，CD组ATG16L1的mRNA表达低于对照组，差异具有统计学意义（p < 0.001）。

在大鼠结肠组织中，CD组ATG16L1蛋白的表达水平低于对照组，差异具有统计学意义（p < 0.01）。

AI建模预测结果

通过调查，确认突变发生在ATG16L1的第300个氨基酸位置，导致氨基酸替换，碱基A被G替换，导致第300个苏氨酸（T）被丙氨酸（A）替换（T300A）。

展示了ATG16L1野生型和突变型蛋白的具体形态。可以看到，随着第300个氨基酸从T变为A，ATG16L1的整体形态发生了一定程度的改变。由于rs2241880位于蛋白质的中心卷曲螺旋结构域（CCD）和WD40结构域之间，该区域的形态变化更为明显。

通过模拟和分析野生型和突变型ATG16L1蛋白，获得了四个模拟指标：均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、回转半径（RG）和溶剂可及表面积（SASA）。与野生型相比，突变体的RMSD随时间（0–100 ns）保持稳定，稳定在约1 nm左右，而野生型虽然也稳定，但维持在约1.5 nm的值。这表明突变体比野生型保持了更稳定的构象，蛋白质刚性增强。RMSF分析：通过比较野生型和突变体的RMSF值，发现突变显著增强了第300个氨基酸附近的构象稳定性。具体而言，在关键功能区域（如活性位点和结合界面），突变体的RMSF值降低，表明结构稳定性增加。突变诱导的稳定性变化：突变体的RMSF波动范围在几个残基位置减小（峰谷差异较小），表明突变可能加强了局部氢键网络或疏水相互作用，从而提高了整体结构稳定性。RG分析：突变体的RG值随时间逐渐稳定（1.9 nm），而野生型也稳定但值为2.0 nm，表明突变体的整体结构更紧凑。突变体的紧凑结构可能影响了功能域的空间排列，从而影响了蛋白质的识别和结合能力。SASA分析：突变体的SASA值（150–160 nm²）总体低于野生型（160–170 nm²），表明其疏水核心在表面的暴露减少。

从突变结果来看，突变体表现出更高的结构稳定性：突变体的RMSD降低，RG减小，SASA暴露更低，表明其构象灵活性受到控制，能更好地维持蛋白质的刚性结构。通过从六个时间段（0至100 ns）提取代表性结构并比较野生型和突变体之间的变化，进一步分析了蛋白质模拟的动态结果。发现第300个氨基酸突变后，蛋白质结构的局部灵活性降低，整体结构变得更加紧凑。因此，突变后蛋白质结构的稳定性增强，这对蛋白质的结合能力产生了一定影响。

从热点图可以看出，第300位点突变为A后，颜色变为蓝色，ddG降低，表明突变后ATG16L1蛋白的自由能降低，其结构稳定性增加，使得ATG16L1突变体比野生型构象更稳定。与野生型相比，这可能影响了其与其他蛋白质的识别和结合能力。

TSA结果

展示了通过TSA测量的ATG16L1野生型和突变型蛋白的稳定性结果。图显示了野生型和突变型蛋白之间Tm值的明显差异，突变体表现出比野生型更高的Tm值。更高的Tm值表明需要更高的温度使蛋白质变性，反映了更大的蛋白质稳定性。这表明突变体蛋白与野生型相比具有增强的稳定性。

Pull-down结果

说明了野生型ATG16L1及其突变体与WIPI2b结合能力的差异。Input组的结果表明实验成功进行，因为每组中带有相应标签的蛋白质被其各自的抗体特异性免疫沉淀。Output组的结果证明了野生型和突变型蛋白与WIPI2b结合亲和力的显著差异。突变体结合的WIPI2b量显著低于野生型结合的量，为我们的计算发现提供了强有力的支持证据。

讨论

基于CD的GWAS数据集，本研究系统评估了基因表达与CD风险之间的遗传预测关联。ATG16L1成为通过四种遗传分析技术（MAGMA、UTMOST、FUSION和FOCUS）汇交识别的共享基因。对ATG16L1进行了共定位分析，确认了该信号位点对CD的显著影响。随后，在动物实验中，我们验证了ATG16L1的表达。与对照组相比，CD组中ATG16L1的mRNA和蛋白质表达水平均降低。这些发现可以增进我们对ATG16L1在CD遗传学和发病机制中作用的理解。

为进一步阐明蛋白质结构变化对功能的影响，本研究结合AlphaFold3结构预测、蛋白质动力学模拟和基于神经网络的热力学稳定性预测模型，探索了ATG16L1第300位点错义突变对蛋白质结构和功能的影响。通过TSA和pull-down assay验证了计算预测。作为与自噬过程密切相关的蛋白质，许多研究表明ATG16L1与细胞自噬功能和免疫反应密切相关。然而，突变对蛋白质稳定性和功能的具体机制仍未完全了解，特别是在分子水平上突变引起的结构变化和热力学稳定性。本研究首次从蛋白质稳定性、动态结构变化和自由能变化等方面全面解释了ATG16L1 300位点突变的机制。

ATG16L1可分为三个结构域：N端ATG5结合域（ATG5BD）、CCD和WD40。其N端参与与ATG5-ATG12复合物的结合，而C端WD40结构域介导膜定位和底物识别。ATG16L1通过其卷曲螺旋结构域与WIPI2b蛋白相互作用，WIPI2b负责将ATG16L1复合物招募到自噬前体膜上，进一步促进自噬体形成。T300A突变位于CCD和WD40结构域之间，邻近一个高度保守的caspase-3切割位点。多项研究表明，T300A突变显著增强了caspase-3对ATG16L1的切割。切割后产生两个片段：N端片段包含ATG5结合域，但由于失去C端区域而无法定位到自噬起始位点；C端片段包含WD40结构域但缺乏ATG5偶联能力，导致自噬功能丧失。

caspase-3在突变后显著增强其切割ATG16L1的能力应从局部蛋白质结构变化的角度来考虑。根据建模预测的蛋白质模型，T300A所在区域没有任何二级结构，这为caspase切割创造了有利条件。突变后，RG和SASA值均降低，表明蛋白质疏水性增加。疏水性的升高可能促使柔性环向疏水核心塌陷，从而通过疏水效应稳定结构。这一观察与RMSF结果一致，RMSF显示突变后第300个氨基酸残基附近的结构稳定性增强。由于caspase-3介导的切割发生在此位置附近，一个适当稳定的构象可能为caspase-3提供更合适的结合环境。此外，ATG16L1中从第296位到第299位（DNVD）的氨基酸序列与第300位氨基酸相邻，该序列类似于caspase-3的DxxD序列。通过突变，从第296位到第300位的氨基酸变为DNVDA，这进一步匹配了caspase-3基序。此外，突变导致第300位局部结构的显著变化，使得DNVD序列与野生型相比更暴露在caspase-3的切割范围内，从而增强了caspase-3的切割能力。

由于T300A位于CCD和WD40结构域之间，传统观点认为该位置的突变对WD40结构域的影响有限。然而，有证据表明，即使在没有caspase-3、caspase-7和其他切割ATG16L1的半胱氨酸蛋白酶的情况下，T300A仍然可以影响蛋白质的功能性，该蛋白质保留其完整的长链结构。具体来说，这种突变影响了WD40与常见伴侣蛋白的结合能力，从而影响了后续的蛋白质功能。WD40已被证明与自噬相关蛋白如WIPI2b结合，也可以影响泛素化和DNA损伤等过程。这些过程的运作依赖于WD40的顶部、底部和周缘表面。这三部分的形成需要WD40的可变区。换句话说，虽然WD40在其折叠上是高度保守的，但其功能仍然需要一定程度的可变性。此外，一项分析WD40电荷分布的研究发现，其顶部主要是疏水的，而底部是带负电荷的亲水的。我们的研究结果表明，T300A突变后，ATG16L1的整体结构变得更加紧凑，其灵活性降低，SASA分析显示疏水性增强，所有这些都可能影响WD40的正常功能。此外，从蛋白质时间阶段分析结果来看，经过100 ns模拟后，突变体的结构与野生型相比显示出显著差异。野生型在模拟过程中保留了WD40环状结构的完整顶部、底部和周缘。然而，经过100 ns模拟后，突变体的结构发生了不规则变化，这可能影响蛋白质的功能表现。TSA和pull-down assay的结果进一步支持了这一结论。TSA证明了突变体的结构稳定性增加，而pull-down assay揭示了突变体与其下游效应器WIPI2b的结合亲和力显著受损。

有趣的是，虽然T300A突变增强了结构稳定性，但它通过破坏其 dimerization 界面而损害了ATG16L1的功能。这种悖论表明治疗策略不应旨在进一步稳定突变蛋白。相反，可以设计靶向蛋白水解调节剂（例如PROTACs）来选择性地降解功能失调的突变体，而等位基因特异性mRNA沉默或基因编辑方法可以抑制其表达。或者，在不影响稳定性的情况下促进功能性二聚化的小分子可能会挽救T300A携带者的自噬流，为具有该变异的CD患者提供精准医疗途径。

虽然本研究整合了计算预测与包括TSA和pull-down assay在内的实验验证，但仍存在几个局限性。首先，尽管TSA证实了ATG16L1 T300A突变体结构稳定性的改变，并且pull-down assay揭示了其与WIPI2B结合的受损，但所有验证都是在体外进行的。未来的研究应采用基因编辑方法和生理细胞模型，在更具生物学相关性的背景下验证这些功能影响。其次，虽然ThermoMPNN模型在热力学稳定性预测中表现出高准确性，但在预测多点突变或协同效应方面可能仍存在局限性。未来的研究可以整合更多实验数据和计算模型，以提高预测的准确性。

结论

本研究阐明了ATG16L1在CD中的作用，并系统表征了T300A突变的结构和功能后果。通过整合来自GWAS、动物模型、基于AlphaFold3的结构预测、分子动力学模拟和ThermoMPNN衍生的ddG计算的证据，我们证明T300A突变增强了ATG16L1的结构稳定性和疏水性。实验上，TSA证实了突变体热力学稳定性的增加，而pull-down assay揭示了其与WIPI2B结合能力的显著受损。然而，这种异常的稳定化破坏了功能性二聚化和效应器相互作用，最终损害了蛋白质功能。这些发现为CD中ATG16L1功能障碍提供了机制见解，并为未来针对该突变的治疗策略提供了理论基础。