基于宿主物种与组织区域的差异揭示海龟微生物组群落结构与功能特征：宏基因组学视角

本综述通过宏基因组测序技术，系统分析了绿海龟、玳瑁和蠵龟三种海龟的口腔、鼻腔和泄殖腔微生物组，构建了包含1073万非冗余基因的海龟微生物基因目录（STMGC）。研究发现组织区域是影响微生物组变异的关键因素（PERMANOVA，R2=0.446，p=0.001），鉴定出389属1445种潜在病原体及157种抗生素抗性基因（ARGs）和697种毒力基因。研究为海龟保护策略制定和"One Health"健康风险评估提供了重要理论依据。

　　

引言

海龟作为长寿迁徙型海洋爬行动物，被提议作为海洋生态系统健康指示物种，但其种群正面临人类活动和气候变化的多重威胁。微生物群落在宿主健康与疾病中扮演重要角色，然而现有研究多局限于16S rRNA测序，对功能特征的认知存在不足。本研究采用鸟枪法宏基因组测序技术，首次对三种濒危海龟（绿海龟、玳瑁、蠵龟）的口腔、鼻腔和泄殖腔微生物群落进行系统性比较分析。

材料与方法

样本采集自海南省海龟救护保育中心61只圈养海龟（48只绿海龟、10只玳瑁、3只蠵龟），通过无菌拭子获取三部位样本并提取DNA。构建的63个混合DNA样本经Illumina PE150平台测序，产生705.81 GB原始数据。使用MEGAHIT进行组装，MetaGeneMark预测开放阅读框（ORFs），最终通过CD-HIT去冗余获得包含10,733,232个非冗余基因的海龟微生物基因目录（STMGC）。采用DIAMOND软件比对NCBI NR数据库进行物种注释，并通过KEGG、eggNOG、CAZy、CARD和VFDB数据库进行功能注释。

结果

微生物群落结构特征

物种注释显示细菌基因占比98.12%，共鉴定165个门类微生物。在门水平上，Pseudomonadota（原Proteobacteria，44.05%）和Bacteroidota（原Bacteroidetes，26.40%）为优势菌门，合计占比70.45%。属水平前十的细菌包括Tenacibaculum、Marinicella、Aliiroseovarius等，共占总量16.29%。

多样性分析

主坐标分析（PCoA）显示组织区域间微生物组成差异显著（R²=0.446，p=0.001），而物种间差异相对较小（R²=0.068，p=0.047）。Alpha多样性分析表明，基于Chao1指数，三个组织区域在所有分类水平上均存在显著差异，口腔区域基因数量最高。

差异微生物分析

LEfSe分析鉴定出54个物种间差异细菌类群和104个组织区域间差异类群。值得注意的是，Pseudomonadota在口腔样本中显著富集（LDA=4.58），Bacteroidota在鼻腔样本中更丰富（LDA=4.65），而Campylobacterota在泄殖腔样本中显著富集（LDA=4.35）。

潜在病原体鉴定

共鉴定389个病原菌属（占总基因25.24%）和1,445个病原菌种（3.85%）。11个属的基因计数超过0.5%，包括Tenacibaculum、Vibrio、Arcobacter等。17个物种基因计数超过0.05%，其中Helicobacter pylori为最丰富的病原菌种。在前30个富集菌属中，11个被归类为病原菌属，其中Paracoccus、Treponema、Campylobacter在绿海龟中更丰富。

功能特征分析

功能注释显示，KEGG、eggNOG和CAZy数据库分别注释了29.35%、76.11%和3.73%的非冗余基因。通过CARD和VFDB数据库分别注释到1,904和344,839个基因，发现157种抗生素抗性基因（ARGs）和697种毒力基因。KEGG代谢通路分析显示微生物功能主要与代谢过程相关，特别是"氨基酸代谢"和"碳水化合物代谢"。

ARGs分析显示糖肽类和四环素类抗性基因为主导抗性类型。值得注意的是，玳瑁中ARGs流行度更高，而毒力基因在蠵龟中更丰富。组织区域比较显示，口腔样本中ARGs含量更高，而泄殖腔样本中毒力基因更广泛。

讨论

研究结果表明海龟微生物组组成和功能存在显著的物种特异性和区域特异性差异。Pseudomonadota的优势地位可能与圈养环境和海鲜饮食有关，该门包含167个潜在病原菌属。Bacteroidota在鼻腔样本中的富集可能与蛋白质消化功能相关，而Campylobacterota在泄殖腔的富集提示其可能形成独特的冷适应群落。

功能分析发现与代谢相关的基因富集，反映了海龟通过微生物酶解食物中复杂碳水化合物的适应性机制。ARGs的分布模式表明圈养环境和养殖鱼类投喂可能导致耐药微生物的引入。毒力基因分析发现与鞭毛运动、铁摄取和转运相关的基因在泄殖腔样本中富集，这些因子可能在病原菌致病过程中发挥关键作用。

结论

本研究首次通过宏基因组学方法系统揭示了三类海龟不同组织部位微生物组的群落结构和功能特征。研究发现组织区域是驱动微生物组变异的关键因素，鉴定出大量潜在病原体和功能基因。这些发现不仅为海龟保护管理策略提供了科学依据，也为理解海龟-海洋-人类健康互作关系奠定了重要基础，对"One Health"健康风险评估具有重要指导意义。