斯洛伐克东部欧洲绿蟾蜍（Bufotes viridis）蠕虫群落的形态学与遗传学整合调查：揭示人为主导景观下的寄生线虫多样性

本研究针对欧洲绿蟾蜍（Bufotes viridis）蠕虫群落特征不清及环境变化影响不明的问题，在斯洛伐克东部13个地点开展整合分类学研究。通过形态与分子方法结合，鉴定出5种线虫（如Rhabdias rubrovenosa、Oswaldocruzia spp.等），更新了物种记录，并发现城市化对群落组成无显著影响（PERMANOVA, p=0.662），为宿主-寄生虫动态研究提供了关键基线数据。

　　

在全球两栖动物种群衰退的背景下，理解宿主与寄生虫之间的相互作用动态正受到越来越多关注。尽管两栖动物在世界范围内面临生存威胁，但关于其寄生虫的认知仍十分有限。深入研究寄生虫群落的组成模式及关键影响因素，不仅能揭示两栖动物及其寄生虫的生态学特性，还对保护生物多样性具有重要价值。欧洲绿蟾蜍（Bufotes viridis (Laurenti, 1768)）作为一种生态可塑性较强、分布广泛的中型蟾蜍，成为寄生虫学研究的理想模型。其栖息地类型多样，从天然草原、湿地到高度城市化区域均有分布，因此可能接触到丰富多样的内外寄生虫类群。然而，以往的相关研究多依赖于传统形态学方法，且距今已有数十年之久，随着分子生物学技术的发展，许多基于形态的物种鉴定可能需要重新评估。此外，急剧的环境变化（如城市化扩张和污染）可能通过影响中间宿主的可获得性而改变寄生虫的传播与生存，进而影响整个寄生虫群落的组成。在此背景下，研究人员选择斯洛伐克东部地区的欧洲绿蟾蜍种群为对象，开展了一项结合形态学与遗传学的综合性寄生虫调查，旨在更新该物种的蠕虫名录，评估城市与乡村生境中寄生虫群落结构的差异，并为宿主-寄生虫互作在人为干扰环境下的响应提供科学依据。

本研究主要依托一系列现代生物学技术手段展开。研究人员收集了来自斯洛伐克东部13个地点的61只路杀欧洲绿蟾蜍个体，通过解剖获取其内脏器官（包括肺、心脏、肝、肾、脾以及大小肠），并在体视显微镜下检查线虫寄生虫。所有发现的线虫均分别保存于70%或96%乙醇中，以备形态学观察和分子生物学分析。形态鉴定主要依据虫体形态特征和寄生部位（如Rhabdiasidae科线虫寄生于肺部，Molineidae科见于小肠，Cosmocercidae科则在大肠），并借助显微镜进行测量和拍照。分子分析方面，针对不同科线虫的特性，分别设计扩增方案：对Rhabdiasidae和Cosmocercidae家族，扩增部分18S rDNA、完整ITS1、5.8S rRNA、ITS2以及部分28S rDNA序列；而对Molineidae的代表，则获取了部分细胞色素c氧化酶亚基I（COI）序列。DNA提取采用DNeasy Blood & Tissue Kit，PCR产物经纯化后送测序。所获序列经MAFFT比对后，采用贝叶斯推断（BI）和最大似然法（ML）构建系统发育树，以确定虫种的分类地位和遗传关系。在数据分析阶段，利用非度量多维标度（NMDS）和基于Bray-Curtis相异性的置换多元方差分析（PERMANOVA）评估城市与乡村地点间寄生虫群落组成的差异。

研究结果首先揭示了欧洲绿蟾蜍中蠕虫的多样性与分布特征。在所有检视的蟾蜍中，共发现1,834只线虫，分属三个科：Rhabdiasidae（512只）、Molineidae（53只）和Cosmocercidae（1,269只）。仅有6个地点同时存在这三科线虫，而Molineidae的分布范围最窄，在13个地点中的7个均未发现。Cosmocercidae是数量上最占优势的科，仅在PKP地点未有记录。Rhabdiasidae则存在于所有地点，感染率从20%到100%不等。通过整合形态与分子数据，共鉴定出5种线虫，包括Rhabdias rubrovenosa、Oswaldocruzia filiformis、O. ukrainae、Aplectana linstowi以及一个未能定种的Cosmocerca物种（暂称Cosmocerca sp. A）。

在 taxonomic and morphological-genetic description 部分，研究人员对各类线虫进行了细致的分类学描述和遗传分析。对于Rhabdias rubrovenosa，基于1,551 bp的序列比对和系统发育分析（图2），确认其与来自乌克兰的同种序列（KF999596）100%一致。形态测量数据（体长4.891–11.828 mm，阴门距前端1.675–3.298 mm，无肛门等）进一步支持其与相近种R. bufonis的区别（表4），这也是该物种在斯洛伐克的首次确认记录。对于Molineidae科，COI序列分析（图4）揭示了Oswaldocruzia filiformis（存在3个单倍型）和O. ukrainae的存在，后者与来自俄罗斯的参考序列完全一致。这两种线虫分别发现于3个和5个地点，感染率与强度均在已知范围内波动。Cosmocercidae科的分子系统树（基于1,149 bp序列，图5）显示其内部存在并系群关系，形态学鉴定支持Aplectana linstowi（在11个地点出现）和Cosmocerca sp. A（在9个地点出现）的存在。后者的形态特征（如雄性具7–8个肛前翼膜）虽近似于Cosmocerca commutata，但缺乏对应的序列支持，因此暂未定种（表6）。这些结果凸显了形态与分子结合在物种鉴定中的必要性，尤其对于Cosmocercidae这类具有高度隐存多样性的类群。

关于寄生虫群落结构在城市与乡村生境间的比较，NMDS排序图（图8）显示Molineidae科与乡村地点存在微弱关联，但PERMANOVA检验（表7）表明，地点类型（ urban vs. rural）对群落组成的解释力度非常有限（R2 = 0.033, p = 0.662），差异并不显著。这说明，简单的城乡二分法不足以捕捉寄生虫分布的整体模式，可能还有更多未被测量的生态因素（如微生境质量、宿主密度和地方气候）在起作用。

在讨论部分，作者对比了历史研究，指出本次调查仅检出线虫类寄生虫，而早期研究（如Prokopic, 1957; Kozák, 1969a, b）曾报告过包括扁形动物、棘头虫在内的更多类群。这种差异可能源于环境变迁导致中间宿主减少，从而影响了复杂生命周期寄生虫的传播。斯洛伐克自20世纪70年代以来的快速城市化、工业增长及土地用途改变，显著改变了低地地区的生态稳定性，而线虫凭借其直接生命周期和较强的抗逆能力，在这种扰动环境中更具生存优势。此外，本研究发现的线虫物种数（5种）远低于历史记录（最多12种），这可能反映了生态过滤效应与方法学差异的共同作用：路杀样本的保存状态可能导致脆弱或稀有寄生虫的漏检，而分子方法的引入提升鉴定准确性的同时，也可能因数据库不足而无法识别所有物种。例如，过去记录的Oswaldocruzia iwanitzkyi很可能实为O. ukrainae的误鉴定，这体现了整合分类学在厘清历史记录中的重要性。

本研究首次提供了斯洛伐克地区欧洲绿蟾蜍蠕虫群落的形态与分子证据，更新了物种名录（如R. rubrovenosa的新分布记录），并强调在人为改变生境中持续监测宿主-寄生虫动态的重要性。尽管城乡分类未能显著解释群落变异，但所获数据为未来研究提供了基线。作者呼吁加强寄生虫分子参考数据库的建设，尤其对于Cosmocercidae等分类复杂的类群，以促进物种界定的精确性。总体而言，这项研究不仅增进了对东欧地区两栖动物寄生虫多样性的认识，也展示了多学科方法在生态寄生虫学中的应用价值。