综述：代谢工程与合成生物学在环境领域的应用：从生物检测、生物修复到生物制造的视角

本综述系统阐述了代谢工程与合成生物学在应对环境污染挑战中的前沿应用。文章重点介绍了三类关键技术：用于污染物实时监测的（生物传感器Biosensors）、用于环境修复的（生物修复Bioremediation）及将废弃物转化为高附加值产品的（生物制造Biomanufacturing）。通过工程化微生物实现（C1化合物）（如CO2、CH4）和（木质纤维素生物质Lignocellulosic biomass）的资源化利用，为开发（生物燃料Biofuels）、（生物材料Biomaterials）及（天然产物Natural Products）提供了可持续解决方案。

　　

生物传感器用于污染物检测

环境监测是评估污染危害和验证治理策略有效性的关键环节。微生物生物传感器通过感应环境变化，为重金属和有机污染物提供实时、现场的快速检测方案，成为传统实验室分析技术的低成本替代工具。其构建核心在于将污染物响应元件与报告基因在微生物宿主中耦合。

转录因子是实现信号转换的常用工具。例如，通过表达锌响应调节蛋白ZntR及其关联的核黄素生物合成基因ribB，可构建检测范围20-100μM的Zn²⁺传感器。蛋白质工程进一步拓展了检测范围：研究者通过对金感应蛋白进行定向进化，开发出特异性响应汞的传感器；基于MopR蛋白结构设计的突变体可实现对甲苯、乙苯等芳香族致癌物的高灵敏度检测，其检测限甚至低于商用LC-MS技术。

为提高响应速度，研究人员设计了合成电子传递途径。通过构建从NADPH到电极的电子传递链，可在2分钟内检测到硫代硫酸盐；将该系统与纳米材料结合后，对内分泌干扰物4-HT的检测时间缩短至3分钟。荧光共振能量转移（FRET）技术也被用于开发实时检测Ca²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺等离子的生物传感器。

报告元件的选择直接影响检测便利性。除了常用的荧光蛋白（GFP、RFP）和生物发光蛋白，可见色素输出系统特别适合现场检测：将金属调节蛋白（CadR、MerR、PbrR）与紫色杆菌素途径耦合，可使大肠杆菌在检测到镉、汞、铅时产生肉眼可见的色斑；利用群体感应系统开发的病原体检测传感器，可通过番茄红素合成途径产生红色色素实现可视化检测。

宿主选择是实际应用的关键挑战。虽然大肠杆菌是常用的模式宿主，但假单胞菌、芽孢杆菌、地杆菌等具有更强环境适应性的微生物正成为新的 chassis 选择。例如在枯草芽孢杆菌中构建的砷传感器，不仅耐受高达2.31mM的砷浓度，还能形成芽孢便于长期保存。

未来发展方向包括利用人工智能驱动的基因组挖掘和AlphaFold辅助的配体-调节剂相互作用分析，开发新型生物传感器，并通过工程化手段优化其检测范围和输出强度。

生物修复应用

生物修复利用微生物降解和解毒污染物的天然能力，是美国环境保护署（EPA）推荐的污染场地清理策略。微生物可自然降解碳氢化合物、氯化物和重金属等污染物，但天然降解速率通常较慢。合成生物学通过引入外源途径、调控元件或宿主工程来提升修复效率。

对于混合污染场景，工程微生物展现出独特优势。通过将大肠杆菌的汞抗性操作子（mer）整合到耐辐射奇球菌中，获得了既能耐受辐射又能将毒性Hg(II)还原为惰性Hg(0)的工程菌株。假单胞菌B13中构建的邻位裂解途径，实现了氯代和甲基芳香化合物的同步降解，避免了错误代谢途径导致的中间产物积累。

合成微生物群落为复杂污染修复提供了新思路。研究发现，金属解毒微生物可通过降低可溶性镉水平来保护有机降解微生物；石油降解菌与生物表面活性剂生产菌的共培养体系，通过增强石油溶解性提高了降解效率。新开发的代谢建模管道SuperCC，能够文档化微生物组内的代谢相互作用，指导合成群落的设计。

从污染场地筛选具有特殊降解能力的天然菌株，结合合理的酶与途径工程、定向进化以及微生物群落工程，将推动生物修复技术的创新发展。

生物制造

生物制造利用活体微生物将低成本碳源转化为高附加值产品，包括生物材料、生物燃料和天然化合物等。除了传统的糖基原料，木质纤维素生物质、大气二氧化碳、塑料废物和工业废料等替代碳源的开发，不仅减轻环境负担，还提供了资源回收的经济路径。

生物利用：将废物流转化为宝贵资源

木质纤维素生物质

作为丰富的碳资源，木质纤维素生物质通常含40-50%纤维素、25-35%半纤维素和15-20%木质素。预处理和解构技术将其转化为可发酵糖（主要是葡萄糖和木糖），但过程中产生的抑制剂会影响细胞生长。适应性实验室进化（ALE）和理性菌株工程被用于提高宿主对常见抑制剂的耐受性。工程化磷酸转移酶系统（PTS）和碳分解代谢阻遏可加速混合糖的共利用。

木质素的高效利用仍面临挑战。白腐真菌凭借其分泌的木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和多铜漆酶等胞外酶，被认为是自然界中最有效的木质素降解者。新研究揭示了黄孢原毛平革菌和线虫疏孔菌的细胞内木质素分解代谢途径。此外，红球菌、假单胞菌和链霉菌等细菌也表现出木质素降解能力，这些途径已被用于木质素的高值化转化。

塑料降解

微生物和酶在温和条件下的降解能力为塑料废物管理提供了新途径。聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）可通过水解酶分解，如伊萨卡烯杆菌分泌的PET水解酶。而主要含C-C和C-H键的聚乙烯（PE）和聚丙烯（PP）难以生物降解，需要烷烃羟化酶和细胞色素P450等酶先在碳骨架上引入可水解基团。缺乏羟基的聚醚聚氨酯（PE-PU）需要通过α-氢提取等氧化策略进行分解。

提高降解效率需要新酶和新菌种的发现，以及酶和菌株的工程化改造。新开发的网络应用PlasticDB整理了具有塑料降解能力的微生物和酶数据库。对于混合塑料废物流，离子液体处理、热解和金属催化化学氧化等化学方法与微生物转化结合的混合策略显示出潜力：通过过渡金属催化自氧化将混合塑料解聚为含氧小分子，再经工程化恶臭假单胞菌转化为单一化学产品。

C1化合物利用

一碳（C1）化合物（CO₂、CO、CH₄、甲酸和甲醇）因其自然界丰度高而成为微生物细胞工厂的重要原料。四氢叶酸（THF）循环是微生物C1利用的核心，将各种C1化合物转化为关键代谢中间体。

甲酸是进入THF循环的关键分子，可通过甲酸脱氢酶（FDH）产生还原力或进入中心代谢。微生物通过伍德-永达尔途径（W-L pathway）或还原甘氨酸途径（rGlyP）将CO₂还原为甲酸；甲醇通过甲醇脱氢酶（MDH）氧化为甲酸；甲烷（CH₄）通过甲烷单加氧酶（MMO）氧化为甲醇后再转化为甲酸；一氧化碳（CO）通过一氧化碳脱氢酶（CODH）氧化为CO₂后进入THF循环。

除了工程化天然C1气体利用微生物（CGUM），如甲基营养菌、蓝细菌和乙酸菌，C1同化途径也被引入多种微生物中。研究人员通过过表达9个生物的17种酶，构建了新型CO₂固定途径，并结合机器学习和理性设计将途径效率提高了两个数量级。共培养体系也展现出潜力：开发的光混养群落消耗甲酸支持细菌生长并产生CO₂，同时被藻类利用。电化学催化可将气态C1化合物转化为甲酸和甲醇等液体化学品，便于微生物利用。

与气态C1底物相比，甲酸和甲醇等液态C1底物水溶性高、生物利用度高。理性途径设计和ALE被用于提高对这些底物的耐受和利用。通过进化食酸罗尔斯通菌提高其甲酸利用能力，基因组测序和RNA-seq发现群体感应相关转录因子PhcA带来了甲酸生长的显著改善。

乙酸利用

乙酸作为经济型原料，可来源于木质纤维素水解、厌氧消化、C1气体转化和工业废流。但高浓度乙酸（低至0.5wt%）对大多数微生物具有毒性和抑制性，会破坏细胞膜导致必需细胞成分泄漏，扩散到细胞内会引起内部pH降低和乙酸阴离子积累，导致阴离子失衡、氨基酸代谢抑制和活性氧物种诱导。

通过过度表达转运蛋白降低细胞内乙酸浓度、工程调控蛋白减轻乙酸诱导的应激反应、理性途径工程增强乙酸利用以及ALE促进细胞生长等策略可提高乙酸耐受性。研究人员采用基于基因组文库的逆向代谢工程方法，发现了新型靶基因WHI2（编码细胞质球状支架蛋白），可提高乙酸胁迫下的葡萄糖和木糖发酵及乙醇产率。创新的酸抗性系统通过工程化酸激活谷氨酰胺酶YbaS将谷氨酰胺转化为L-谷氨酸并释放氨中和质子。

乙酸通过ACS途径和ACK-PTA途径转化为乙酰-CoA进入中心代谢。过度表达整个乙酸利用途径可使乙酸消耗率提高15%。通过增强乙酰-CoA向目标合成途径的通量可进一步驱动碳流：过度表达乙酰-CoA羧化酶并抑制脂肪酸途径的碳流，使乙酸生产3HP的产量提高约1.5倍。过程开发也取得进展：基于代谢通量模型和在线测量的半连续系统与细胞回收和进料控制相结合，使解脂耶氏酵母能够处理3%乙酸并实现高脂质生产。

生物转化生产高附加值产品

生物燃料合成

从可再生原料生产生物燃料是石油基燃料的有前途的替代方案。生物燃料可分为沼气、生物醇和生物柴油。生物醇，特别是乙醇和丁醇，作为化石燃料的可持续替代品受到广泛关注。这些短链醇的生物生产主要利用常见前体乙酰乙酰-CoA和2-酮酸。

脂肪酸是生物燃料合成的重要前体，可转化为具有高能量密度的燃料分子。其衍生物，包括脂肪酸烷基酯和脂肪酸衍生烷烃，因其高能量密度而成为有价值的生物燃料。脂肪酸生物合成途径已在多种宿主中得到广泛工程化，这些宿主天然产生C16至C18长链脂肪酸，需要转化为酯或烷烃才能用作燃料。产油酵母因其高效的脂肪生成成为脂肪酸生产的有前途的工业宿主，这些物种可自然积累至少占细胞干重20%的脂质，部分物种甚至可积累超过80%。

萜类化合物是一大类次级代谢产物，部分衍生物因其低吸湿性、高能量含量和良好的低温流动性而成为有前途的生物燃料。萜类骨架由甲羟酸（MEV）途径或1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP）途径中的常见前体异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）合成。异戊醇和异戊烯醇是来自半萜的优秀生物燃料和生物燃料前体。

合成生物学通过生产多种生物燃料 revolutionized 生物燃料生产，但某些生物燃料对微生物宿主的毒性会阻碍生产力。多组学分析、ALE和原位产物回收（ISPR）为提高耐受性和提高生物燃料产量提供了有效策略。与下游产物分离和化学催化相结合的低成本原料生物燃料生产的规模化，对于实现经济可行性至关重要。

生物材料合成

生物材料分为非活性材料和活性材料。非活性材料通常指生物聚合物和蛋白质材料，如聚羟基烷酸（PHA）、胶原蛋白、淀粉样蛋白和丝样多肽。由于固有的生物相容性、可生物降解性和多样的结构特性，包括聚酰胺、多糖、聚酯和聚磷酸盐在内的生物聚合物是有前途的生物材料，可用于组织工程、药物递送和伤口愈合。

活性材料是将活细胞纳入材料中以实现特定功能（如自愈合和环境响应）的动态复合材料。活性材料可通过基因修饰具有细胞外基质（如生物膜）的天然微生物系统，或将生物活性分子生产宿主嵌入人工基质中创建。生物膜作为一种有前途的环境应用活性材料，是嵌入自产细胞外基质（含蛋白质、多糖、核酸和脂质）中的微生物。生物膜的自我再生、可扩展性和可调性使其成为各种应用的高度通用候选者，如环境修复和腐蚀防护。代谢工程方法，如引入信号通路使工程生物膜具有环境感应和响应能力，已被用于优化宿主生物膜特性。

天然产物

天然产物及其衍生物（通常指次级代谢产物）构成了药物和食品添加剂的重要部分。在代谢工程和合成生物学出现之前，大多数有价值的天然产物都是从动植物中提取的。随着基因工程的发展，研究人员使用合理的工程方法来表征新靶点并将其整合到各种宿主中进行天然产物合成。

天然产物主要分为三类：酚类、萜类和生物碱。酚类和萜类是广泛用作有价值天然产物生物合成前体的芳香族化合物。第一例工程化酚生物合成途径是通过在恶臭假单胞菌中过度表达异源酪氨酸酚裂解酶（TPL）从酪氨酸生产酚。此后，多种酚类化合物已利用芳香族氨基酸作为前体合成。酪氨酸和苯丙氨酸的衍生物，如肉桂酸、对香豆酸和柚皮素以及各种黄酮类化合物，已在细菌和酵母中成功生产。

生物碱是在许多植物中发现的结构多样的含氮化合物。代谢工程中合成的典型生物碱包括苄基异喹啉生物碱（BIA）和单萜吲哚生物碱（MIA）。BIA源自两个酪氨酸分子，具有复杂结构，显示出多种治疗用途。BIA及其衍生物，如（S）-网状番荔枝碱、小檗碱、诺斯卡品和卤代生物碱，已在模式生物如酿酒酵母和大肠杆菌中生产。MIA是治疗疼痛、成瘾和抑郁的有前途的新支架。MIA的生物合成途径依赖于（S）-strictosidine，由色氨酸衍生的色胺和secologanin缩合产生。

天然产物的微生物生物合成为传统化学合成和植物提取提供了可持续替代方案。天然产物合成通常需要多步生物合成途径，涉及许多未表征的催化步骤和需要在不同细胞器中协调催化的酶。代谢工程的进展已成功克服这些挑战，实现了长代谢途径的组装。

结论与未来展望

工业实践释放污染物加剧了日益严重的污染问题。为解决这些挑战，利用代谢工程和合成生物学的微生物方法已被开发用于污染物监测、有效生物修复和生物制造。

为进一步扩展微生物对更多污染物的生物传感，快速筛选新型生物传感器至关重要。组学技术的进步可加速新型生物传感器的识别。天然生物传感器可能无法在所需污染范围内响应，因此可能需要工程化来调整现有生物传感器系统的动态范围、灵敏度和特异性。合成生物学提供了大量控制生物传感器响应及其特异性的工具，如计算指导的设计原则、调节子和启动子工程。此外，现有生物传感器针对复杂多输入/输出遗传电路的工程化可实现多种污染物的同时检测。

生物修复是解决污染的补充策略，提供了有前途的途径。同时，生物修复策略可通过开发具有增强降解能力的新生物体而发展。建立适合原位现场生物转化的微生物底盘的一个挑战是，它们可能受到碳源有限、缺氧和恶劣环境条件（如极端pH、次优和波动的温度和渗透压）的影响。此外，由生物和非生物因素控制的细胞间相互作用的复杂性可能进一步限制污染物降解效率，这需要在相关现场条件下进行菌株评估和优化以应对这些挑战。

微生物生物制造在过去十年中吸引了越来越多的兴趣，作为利用丰富廉价原料合成高附加值化学品的有前途的途径。尽管已成功生产多种产品，但通常滴度、速率和产量不足以实现商业可行性。这通常受到低生产产量、原料高成本和放大挑战的限制。为有效降低产品的最低销售价格，开发能够利用低成本、丰富和未充分利用原料的高效生物合成途径至关重要。此外，进一步开发具有有利工业相关特性的新型非常规宿主可能会提高产量并降低成本。这些方法共同促进生物合成过程的滴度、产量和速率的改进，从而扩展到广泛的工业部门应用并培育更强大的制造范式。