卡格列净重塑遗传多样性UM-HET3小鼠衰老海马并减轻阿尔茨海默样病理：多组学揭示性别特异性神经保护机制

本刊推荐：本研究通过多组学整合分析（转录组、蛋白组、代谢组）揭示SGLT2抑制剂卡格列净（Cana）在衰老模型中通过增强线粒体功能、cGMP–PKG信号和抑制神经炎症网络，显著改善雄性小鼠海马依赖性学习记忆功能，并减轻5xFAD模型Aβ斑块负荷和神经炎症。研究首次系统阐释Cana通过性别特异性机制重塑脑衰老微环境，为阿尔茨海默病（AD）的代谢干预提供全新视角。

　　

引言

衰老是认知衰退和神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病，AD）的重要风险因素。AD患者表现出明显的病理变化，包括微管相关蛋白tau的丝状包涵体、淀粉样β（Aβ）在老年斑中的细胞外沉积、显著的神经炎症和神经元细胞丢失。尽管针对淀粉样蛋白和tau病理学已付出大量努力，越来越多的证据表明代谢功能障碍和神经炎症在疾病的发生和进展中起关键作用。支持这一点的是，患有胰岛素抵抗、肥胖和代谢紊乱的个体发生AD的风险更高。在中枢神经系统（CNS）内，海马体对代谢变化特别敏感，这是由于其对记忆和学习过程的高能量需求，而海马体变化与认知障碍、痴呆和AD有关。虽然目前尚无AD的有效治疗方法，但已有建议认为改善代谢健康、减少与年龄相关的神经炎症并延长健康寿命和寿命的药物可能被重新用于治疗神经退行性疾病如AD。

干预测试计划（ITP）已鉴定出几种治疗手段能成功延长遗传多样性UM-HET3小鼠的寿命并改善代谢健康，包括钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂（SGLT2i）卡格列净。卡格列净（Cana）是一种FDA批准的药物，常用于治疗2型糖尿病（T2D）。SGLT2i通过阻断肾近端小管中的葡萄糖重吸收起作用，导致尿葡萄糖排泄增加并通过胰岛素非依赖性机制改善血糖控制。随机临床研究表明，SGLT2i表现出许多多效性作用和益处，包括心血管和全因死亡率降低，与其对糖尿病的影响无关。

在小鼠中，Cana使雄性小鼠的寿命延长14%，并显著延缓所有组织中与年龄相关的病变，但雌性小鼠则无此效果。我们之前的研究表明，长期（约20个月）Cana治疗显著减少了30月龄雄性小鼠海马体和下丘脑的神经炎症，改善了代谢健康、神经肌肉功能、 locomotor activity和焦虑样行为。这种表型表明Cana对认知功能和代谢调节关键脑区具有广泛的神经保护作用。然而，Cana对雄性的益处远大于雌性的证据强调了我们对治疗干预在不同性别间表现的理解存在关键差距。这些发现为重新利用Cana预防或延缓年龄相关神经退行性疾病提供了强有力的理论依据。

Cana对海马体影响的分子机制及其对认知和中枢代谢的影响在很大程度上尚未探索。我们采用多组学策略，整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学，以获得对Cana治疗在衰老海马体中诱导的复杂生物学变化的系统水平理解。多组学分析提供了更详细的疾病发病机制理解，并已广泛应用于脑衰老和神经退行性研究。例如，多组学分析（代谢组学和转录组学）揭示了6、12和24月龄小鼠海马体中存在神经炎症、激活的胶质信号、失调的突触信号和受损的代谢。我们的整合方法揭示了长期Cana治疗以性别特异性方式重编程海马体分子通路，支持改善老年雄性的认知功能和减少神经炎症。

为了验证我们的发现，我们研究了用Cana治疗的5xFAD小鼠的AD进展。5xFAD小鼠过表达含三个家族性阿尔茨海默病（FAD）突变的人淀粉样前体蛋白（APP），以及含两个额外FAD突变的人早老素-1（PSEN1）。这些小鼠表现出AD的标志特征，包括认知缺陷、淀粉样斑块沉积、性别特异性差异和从4到12月龄的神经炎症变化，重现了人类AD病理的许多方面。我们研究的数据建立了葡萄糖代谢与衰老过程中认知功能之间的联系，证明针对外周和中枢葡萄糖代谢的Cana可以延迟认知衰退和与AD相关的神经病理特征。我们的结果将Cana定位为在年龄相关神经退行性背景下有希望的治疗重新利用候选物。

结果

Cana治疗改善中年雄性小鼠的认知功能

为了评估Cana对认知和神经运动功能的影响，UM-HET3小鼠从7月龄开始治疗，并在12-14月龄进行行为测试。Cana治疗的雄性小鼠在开放场中心花费的时间显著更长，表明焦虑样行为减少。值得注意的是，总行进距离组间无差异，表明在此年龄 locomotor activity尚未受到影响。为了进一步评估Cana对认知功能的影响，我们通过测量在Barnes迷宫中4天训练期间找到目标孔的延迟来评估空间学习和记忆。在获取阶段（训练第1-4天），Cana治疗的雄性花费显著更少的时间找到目标孔，表明学习加速。Cana治疗的雌性仅在第四天显著。空间工作记忆（短期和长期记忆，STM和LTM）测试在第5天和第12天进行，以评估对先前学习的目标孔的参考记忆。在这两天，Cana治疗的雄性定位先前学习的目标孔显著快于对照雄性，并在目标象限花费更多时间，表明记忆保留增强。这些结果显示了显著的性别效应和性别×Cana饮食交互作用。总之，这些结果表明Cana改善海马依赖性学习和记忆并减少焦虑样行为，特别是在中年雄性中。

Cana治疗小鼠的海马蛋白质组学分析

使用高效液相色谱/质谱法测量海马体中的Cana水平。与我们之前的研究一致，雌性海马体中的Cana水平显著高于雄性。认知功能和行为由海马体控制。我们采用 unbiased 海马蛋白质组学方法了解Cana治疗小鼠行为改善的分子机制。我们在Cana治疗的雄性中鉴定出129个下调和157个上调的蛋白质，在Cana治疗的雌性中鉴定出56个下调和97个上调的蛋白质。主成分分析（PCA）揭示了每组对Cana的 distinct 反应。差异表达蛋白质的基因本体（GO）分析显示，在Cana治疗的雄性小鼠中，认知功能和代谢通路富集。具体而言，“β淀粉样形成的负调控”通路在Cana治疗的雄性中富集最显著，与对照组相比显示出惊人的40倍增强。 top 上调蛋白质包括PIN1、BIN1、RTN3、GGA3和SORL，已知可抑制淀粉样ogenic APP加工并减少Aβ积累。涉及代谢通路的其他改变蛋白质，包括分解代谢过程、脂质代谢、碳水化合物代谢和脂肪酸代谢过程，显示在热图中。Cana治疗的雌性表现出主要与代谢功能相关的通路富集，包括“脂肪酸生物合成”、“ATP合成”、“脂肪酸代谢”和“雌激素生物合成过程”。这种富集是由关键代谢蛋白质的上调驱动的，例如ATP5E、ATP5I、MECR、NDUDBB、S27A4和ASAH1，表明Cana雌性小鼠能量相关过程的潜在重塑。

Cana治疗小鼠的海马代谢组学分析

蛋白质组学中看到的性别依赖性富集代谢通路促使我们评估海马体的代谢组。我们对12月龄小鼠进行了非靶向海马代谢组学。PCA表明雄性和雌性治疗组之间存在 distinct 聚类，表明不同的反应。我们在Cana雄性中鉴定出103个差异调节的代谢物，在Cana雌性中鉴定出142个。两性都表现出氨基酸代谢物丰度增加和碳水化合物代谢物减少，表明海马体代谢向氨基酸利用转变。重要的是，在Cana雄性中， top 上调的代谢物，如磷脂酰乙醇胺、n-花生四烯酰牛磺酸、棕榈酰乙醇酰胺和二十二碳三烯酸，都与抗炎信号和神经保护相关。此外，雄性代谢物集富集分析（MSEA）显示嘧啶和谷胱甘肽代谢富集，对神经元修复和氧化 resilience 至关重要。在Cana治疗的雌性中，大多数上调的代谢物与脂质代谢和重塑相关，例如C24:1鞘磷脂、gingerglycolipid C和1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。雌性MSEA表明鞘脂通路和氨基糖代谢激活。只有两个下调的代谢物，赤藓糖和1-(9Z-十八碳烯酰)-2-(9Z,12Z-十八碳二烯酰)-sn-甘油-3-磷酸胆碱（PC (18:1/18:2)），在Cana治疗的雄性和雌性小鼠之间共享，表明Cana诱导的性别非依赖性代谢转变。具有已知抗神经炎症特性的雄性特异性肾上腺酮和亮-甘-组在雄性中上调但在雌性中下调，表明Cana对海马代谢的性别特异性影响。

Cana治疗小鼠的海马转录组学分析

为了理解Cana对转录重塑的影响，我们对用Cana治疗12和25月龄小鼠的海马组织进行了 bulk RNA测序。在12月龄时，差异基因表达分析显示Cana治疗的雄性中有403个上调和469个下调基因，雌性中有631个上调和834个下调基因。其中123个基因在两性间共享，表明存在共享和性别特异性转录反应。共享基因的KEGG和GO通路分析显示常见富集于行为和基因调控过程，包括“转录控制”、“MAPK级联调控”和“饮水行为”，可能反映了SGLT2i对饮水量的直接影响。PCA图如图所示。在雄性中，转录组重塑的特征是KEGG通路强烈富集，涉及“氧化磷酸化”、“昼夜节律”和神经退行性疾病，包括“阿尔茨海默病”。Cana下调了炎症和胰岛素相关信号的关键基因（Socs1、Irs2、Irs4、Rps6ka4、Jund、Akt1s1、Map2k2和Bace1），而上调基因与代谢调控和神经保护相关（Irs1、Phkg1、Flot1、Casp9、Csnk2b和Wnt11）。Cana治疗的雌性显示富集的胰岛素、MAPK、mTOR、谷氨酸能、GABA能 and 长寿相关信号通路。这种富集主要由胰岛素信号（Akt2、Irs3、Pdk4）、突触功能（Grm3、Gabrd、Gad2）和适应性可塑性（Arc、Calb1）关键基因的下调驱动，表明雌性的性别特异性转录反应。在25月龄时，Cana治疗的雄性保持了12月龄时观察到的转录变化。PCA图如图所示。具体而言，我们观察到“神经系统发育”和“神经元分化”、“突触可塑性”、“胰岛素信号通路”和“先天免疫反应”的富集，以及神经炎症基因如Nod2、Il34和Parp14的抑制。25月龄Cana治疗雌性的GO分析显示认知和突触活动过程富集，包括“ locomotor 行为”、“联想学习”、“轴突导向”、“长期记忆”和“突触增强”。这些通路主要由关键基因如Egr1、Arc、Calb1、Fos、Abcc8、Prkacb、Itpr1和Camk4的下调驱动。有趣的是，与“胰岛素受体”和“MAPK信号”通路相关的通路也富集，Akt2和Foxo3下调，Irs1基因上调。我们在老年Cana治疗雌性中检测到一群上调和下调的免疫和炎症基因。在两个年龄组中，Cana雄性表现出38个共享基因，包括上调的线粒体和代谢基因，如Creb1、Irs1、Irs2、Smn1、Cd84、Ccr2、mt-Nd2、mt-Nd4、mt-Nd5、P2ry13和Slc10a3、Slc46a3，以及下调的促衰老和炎症基因，如Glo1、Pm20d1和Insig1。相比之下，在雌性两个年龄组（12和25月龄）的共享基因中，我们观察到染色质修饰剂和DNA损伤基因（Bend3、Zbtb16和Parp9）的持续上调。同时，Akt2、Calb1、Egr1、Egr4、Hhex和Lrrk2保持下调，表明可塑性和信号减少。

12月龄小鼠的整合多组学分析

为了获得Cana对海马体影响的系统水平理解，我们对12月龄小鼠进行了转录组学、蛋白质组学和代谢组学的整合分析。维恩图说明了在Cana治疗雄性中鉴定的显著基因、蛋白质和代谢物之间的重叠。我们发现Irs4和Irs2基因与 elevated IRS1、MGLL和GNAS1蛋白质重叠， alongside cGMP代谢物的上调，所有这些都是海马体中胰岛素信号、代谢过程、突触可塑性和记忆功能的关键调节剂。随后，我们使用KEGG注释检查了cGMP信号作为跨组学层的共享机制通路。这种整合分析揭示了在Cana治疗雄性中与cGMP信号直接或间接相关的52个差异表达基因、28个蛋白质和10个代谢物。值得注意的是，Gng3、mt-Nd5和Slc24a4存在于转录组和蛋白质组数据集中。相比之下，在雌性中，我们未发现跨转录组、蛋白质组和代谢组层的协调分子特征。虽然观察到个体分子变化，但它们未汇聚到共享通路上，表明Cana在雌性中的影响涉及 distinct 机制的性别特异性差异。

Cana治疗延缓5xFAD小鼠的AD病理

海马体对Cana的反应促使我们研究其在5xFAD（一种AD小鼠模型）中的神经保护和代谢效应。Cana治疗在3月龄开始，早于该模型报告的AD病理发作。实验设计如图所示。到7月龄时，5xFAD小鼠表现出高血糖，而Cana治疗的5xFAD两性小鼠维持 normoglycemia。体重、脂肪量和瘦体重未受基因型、性别或治疗影响。免疫组化分析显示Cana治疗的5xFAD雄性海马体中Aβ斑块负荷显著减少（Cana效应p < 0.05，性别p < 0.05），特别是在齿状回（DG）和CA3亚区（Cana效应p < 0.05和性别p < 0.05）。相比之下，Cana治疗的5xFAD雌性斑块负荷减少未达到显著性。小胶质细胞（Iba1⁺）和星形胶质细胞（GFAP⁺）标志物的分析揭示了Cana治疗在5xFAD小鼠中的性别特异性效应。在雄性中，Cana显著减少了DG和CA3亚区的小胶质细胞增生（Cana效应p < 0.001和p < 0.05，性别p < 0.001），将Iba1⁺细胞数恢复至野生型对照所见。CA3星形胶质细胞增生，如GFAP⁺染色所示，在Cana治疗雄性中也减少。相比之下，Cana治疗的5xFAD雌性仅在CA3亚区显示小胶质细胞活化显著减少，DG或GFAP⁺星形胶质细胞数无变化。与此一致，5xFAD雄性和雌性中的斑块被活化的小胶质细胞包围，Iba1和CD68阳性，后者是吞噬活性的标志物。

Y迷宫测试对7月龄小鼠的工作记忆进行了评估。Cana治疗的5xFAD雄性表现出比未治疗5xFAD雄性显著更高的自发交替百分比，表现类似于野生型对照，表明空间工作记忆改善。雌性组间无自发交替差异。在此年龄，5xFAD小鼠在握力、 rotarod 性能或短期识别记忆（新物体识别）方面无缺陷。这些发现证明Cana治疗改善了5xFAD雄性小鼠的代谢功能障碍、减少了标志性AD病理并保留了认知性能。Cana在5xFAD雌性中的效应仅限于CA3亚区小胶质细胞增生的减少。

讨论

在此，我们证明FDA批准的SGLT2i卡格列净（Cana）在衰老雄性小鼠中发挥 potent 神经保护效应。Cana治疗增强了海马依赖性学习和记忆，显著减少了AD病理，并重编程了与能量代谢、神经炎症和胰岛素信号相关的关键分子通路。使用整合多组学方法，我们展示了跨转录组、蛋白质组和代谢组层的神经保护和代谢程序的整合激活，这些与在老年Cana治疗雄性中观察到的行为改善和神经病理 resilience 一致。相比之下，雌性表现出减弱的分子反应，功能益处有限，证明了海马衰老和药物反应性的性别特异性差异。我们的发现表明卡格列净可作为 gerotherapeutic 重新利用候选物，以在衰老过程中保存认知功能和延迟AD相关病理。

在UM-HET3雄性小鼠中，Cana上调了涉及胰岛素信号、突触功能、学习和记忆以及β淀粉样形成负调控的关键基因和蛋白质。这种分子谱伴随着增强的cGMP-PKG信号、谷胱甘肽和嘧啶代谢以及线粒体功能，这些是衰老过程中神经元 resilience 的关键通路，表明Cana可能发挥神经保护效应的合理机制。cGMP信号和嘧啶代谢先前已与保护 against 认知衰退和AD病理相关联。例如，通过磷酸二酯酶（PDE）抑制的药理激活cGMP改善了AD小鼠模型中的突触可塑性和记忆，而增强 de novo 嘧啶合成已显示改善衰老和AD动物模型中的突触功能和保护 against 认知衰退。未来研究将有必要确定cGMP–PKG信号是否在介导Cana对海马功能和衰老的影响中起直接作用。

值得注意的是，我们鉴定了重叠的分子特征，如 decreased Irs2和 increased Gng3、Slc24a4和mt-Nd5表达。有趣的是，Irs2（胰岛素受体底物2）是下游胰岛素信号的关键调节剂，其在大脑中的缺陷已显示延长小鼠寿命。GNG3，G蛋白的γ亚基，调节突触传递，并与年龄相关认知衰退和行为缺陷相关联。值得注意的是，Gng3敲除小鼠表现出对癫痫的易感性，表明在神经元兴奋性和认知稳定性中的作用。ND5（NADH脱氢酶亚基5），线粒体复合物I的核心组件，在人类和啮齿类模型的神经退行性条件中经常被破坏。

UM-HET3 Cana治疗的雄性和雌性在衰老过程中表现出海马体的转录重塑。然而，只有雄性显示对Cana治疗的清晰认知和年龄相关脑改善。在之前的工作中，我们证明长期Cana治疗选择性减少了25月龄雄性海马体中的神经炎症和mTOR信号，同时增强了胰岛素敏感性，但雌性中无此效果。跨转录组、蛋白质组和代谢组层的这些分子反应可能 underlie 在老年Cana治疗雄性中观察到的生化和行为改善。有趣的是，虽然Cana治疗的雌性显示与胰岛素信号、突触传递和长寿调控相关通路的转录富集，但这些变化主要由关键功能基因的下调驱动，包括Akt2、Irs3、Pdk4、Arc和Calb1。相比之下，在蛋白质组水平，Cana治疗的雌性表现出通路富集，如脂肪酸代谢和ATP合成， with 线粒体能量生产核心蛋白质的上调，如ATP5E、ATP5I、MECR和ASAH1。虽然这些分子转变表明能量相关过程的潜在重塑，但它们未转化为认知或神经病理益处。雌性中转录组和蛋白质组反应之间的解离可能反映了在认知功能关键神经元电路中缺乏整合的分子重塑。

在12-14月龄UM-HET3小鼠中进行的行为测试证明Cana增强海马依赖性学习和记忆并减少焦虑样行为，但仅在雄性小鼠中。这些变化与在12月龄时观察到的转录组和蛋白质组特征一致，包括涉及突触可塑性、胰岛素信号、线粒体代谢和氧化磷酸化的通路富集。到25月龄时，这些保护性分子特征在雄性中保持富集，表明海马体网络的 remodeling。作为支持，我们之前的研究证明在老年雄性而非雌性小鼠中，海马体保持胰岛素反应性、减少的神经炎症和mTOR信号，所有这些都是保存的突触和代谢功能的标志。雄性中的这种分子重塑可能为我们在30月龄时观察到的增强的 exploratory 行为和减少的焦虑样表型提供了机制基础。总之，这些发现表明Cana治疗 initiates 海马功能的长期变化，支持雄性小鼠的晚年行为 resilience。

Cana治疗雄性的蛋白质组学分析揭示了β淀粉样形成负调控的40倍富集，包括关键蛋白质如BIN1、SORL1、RTN3、GGA3和PIN1的上调。这些蛋白质调节淀粉样前体蛋白（APP）运输、加工、淀粉样ogenic 切割和清除，表明 against AD病理的协调蛋白质稳态反应。值得注意的是，APP和MAPT也上调。然而，这些蛋白质除非异常切割，否则不会变得致病。这表明Cana治疗抑制早期β淀粉样积累。显著地，我们证明在病理发作前用Cana治疗5xFAD小鼠导致海马淀粉样β斑块负荷 dramatic 减少，特别是在海马体，以及斑块周围小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生的显著减少，这些病理通常在该模型中观察到。这些效应主要在雄性中观察到，表明Cana治疗可以抑制AD中的早期神经炎症和淀粉样病理，特别是如果早期使用。未来研究使用单细胞分辨率的空间转录组学与免疫组化共定位将有必要在细胞 context 内映射我们分析鉴定的关键靶点的转录变化。

我们的发现与先前报告一致，显示Cana延长雄性而非雌性小鼠的寿命。有趣的是，尽管饮食药物水平匹配，Cana水平在雌性血液和大脑中始终更高，包括海马体和下丘脑。无论如何， prolonged Cana摄入导致两性老年小鼠食物和水量摄入增加和能量稳态改善。雌性海马体中更高的Cana积累未转化为在雄性中观察到的认知或神经病理益处。Cana神经保护效应的性别特异性差异可能源于多种因素，包括药效学变化，以及大脑区域和细胞类型对药物的特异性敏感性。我们之前报告雄性大脑中 overall 表达更高水平的Sglt2，这可能促进药物与神经靶点的相互作用。Sglt2也在星形胶质细胞和周细胞中表达，表明转运蛋白的不同细胞分布可能影响Cana反应性。此外，小胶质细胞和星形胶质细胞状态高度受雌激素影响，这可能进一步以性别特异性方式调节炎症状态和突触重塑。总之，这些因素可能导致雄性的有益效应，但引起雌性的一些脱靶效应，特别是由于雌性中 elevated 药物积累。未来研究，结合空间转录组学和单细胞分析，对于解析Cana的区域和细胞类型特异性 actions 以及确定药物生物利用度、Sglt2表达和激素如何相互作用导致性别特异性效应至关重要。

越来越多的临床证据表明SGLT2i可能降低T2D和心血管疾病患者的痴呆风险，可能通过改善血糖控制、心血管功能和炎症。此外，最近的荟萃分析报告与使用其他降糖药的患者相比，使用SGLT2i的患者痴呆 incidence 显著更低。虽然SGLT2i的代谢益处似乎在男性和女性中相似，但与痴呆风险相关的发现更可变。一项荟萃分析发现使用SGLT2i的男性患者痴呆 incidence 显著减少，但女性中无此效果。相比之下，一项大型基于人群的研究发现无显著性别差异，表明认知保护可能跨性别发生。然而，这些发现主要限于代谢或心血管疾病患者，使得SGLT2i是否能在无代谢疾病的情况下具有认知益处 unclear。在此，我们通过证明Cana改善非糖尿病、正常衰老小鼠的海马功能和分子 resilience 来解决这一差距，证明SGLT2i在脑衰老和AD中的神经保护作用。虽然其他几种抗衰老干预措施，如雷帕霉素和阿卡波糖，先前已在AD小鼠模型中显示有益效应，但只有Cana提供转化益处，因为它已是FDA批准的药物，常用于T2D，具有广泛的临床使用。

虽然我们的发现提供了关于Cana神经保护效应的重要数据，但应承认几个局限性。我们未剖析Cana对海马功能影响的细胞类型特异性机制，例如其对小胶质细胞、星形胶质细胞或神经元的影响。未来研究应纳入单细胞或空间转录组学以阐明每种细胞类型对Cana神经保护 actions 的贡献。此外，我们研究中观察到的性别特异性反应需要进一步 investigation。此外，虽然5xFAD模型提供了测试Cana对淀粉样病理和神经炎症影响的快速和稳健平台，但它代表了一种 aggressive 和早发性AD形式，未完全反映迟发性AD的逐渐病理。未来研究应评估Cana在更好模拟散发性AD中所见慢性进展和病理的模型中的效应，例如PS19或TREM2缺陷小鼠。值得注意的是，我们在无淀粉样病理的老年UM-HET3小鼠中的研究证明了Cana减少神经炎症和改善认知性能的能力，支持Cana的更广泛神经保护效应。总之，我们的发现确立卡格列净作为有希望的AD预防 gerotherapeutic 候选物，能够调节关键神经退行性通路、减少淀粉样病理并在衰老过程中保存认知功能。