膳食富甘露聚糖组分通过调控肠道菌群与TLR5/NF-κB信号通路缓解仔猪断奶应激

本研究揭示膳食富甘露聚糖组分（MRF）通过重塑肠道菌群结构、提升短链脂肪酸（SCFAs）水平，并抑制TLR5/NF-κB炎症通路，显著降低断奶仔猪腹泻率并改善肠道健康，为替代抗生素提供新策略。

　　

引言

在现代生猪养殖中，断奶后腹泻（PWD）是导致仔猪生长迟滞和死亡的主要原因，常与肠道炎症及宿主对环境应激的适应性下降相关。当前养殖业普遍在断奶过渡期饲料中添加金霉素（CTC）作为生长促进剂和预防手段，但这种做法导致多重耐药肠杆菌科细菌广泛流行，加剧抗菌素耐药性危机，不仅削弱治疗效果，还通过食物链传播耐药病原体，对人畜健康构成严重威胁。因此，开发能恢复肠道健康且不产生耐药性压力的抗生素替代品迫在眉睫。

富甘露聚糖组分（MRF）是一类从高等植物和酿酒酵母细胞壁中提取的寡糖，因其益生元特性在饲料工业中备受关注。与水解甘露寡糖（MOS）不同，MRF保留聚合甘露糖结构，能抵抗宿主消化酶降解，具有更强的肠道病原体吸附能力，可有效抑制微生物定植和减轻肠道屏障损伤。研究表明，MRF能抑制病原体呼吸作用，同时促进丁酸盐产生菌增殖。断奶常引发仔猪肠道菌群失调和炎症反应，Toll样受体（TLR）介导上皮损伤并启动炎症信号通路。尽管MRF已被报道可增加绒毛高度并降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和TLR4表达，但其缓解肠道炎症的具体机制尚不明确。本研究提出MRF可能通过两种机制发挥免疫调节作用：直接调控上皮模式识别受体信号，以及通过微生物衍生的短链脂肪酸（SCFA）增强屏障完整性和抑制NF-κB介导的炎症级联反应。

材料与方法

研究选用90头21日龄杜洛克×长白×约克夏（DLY）杂交仔猪，平均体重7.0±0.5 kg，按性别平衡原则随机分为3组，每组5个重复，每个重复6头猪。试验设计包括对照组（CON）、添加100 mg/kg金霉素的商业金霉素组（ANT）和添加800 mg/kg MRF的试验组（MRF）。饲料配方参考美国国家研究委员会（NRC, 2012）营养需求，基础日粮组成详见表格。试验期28天，自由采食和饮水。每周记录体重和采食量以计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。每天记录腹泻发生情况，计算公式为：腹泻率=Σ（每栏腹泻猪数×腹泻天数）/（总猪数×28天）×100%。试验结束后每组随机选取5头猪屠宰取样，空肠、回肠和结肠组织用4%多聚甲醛固定用于形态学分析，结肠组织速冻于液氮用于转录组测序和分子实验，结肠食糜保存于-80°C用于微生物组成和SCFA浓度分析。

肠道组织经石蜡包埋后切片，苏木精-伊红（H&E）染色，显微镜下观察并随机测量肠绒毛和隐窝结构。采用TRIzol试剂提取结肠组织总RNA，转录组测序由联川生物完成。分子对接中以甘露聚糖（PubChem CID: 25147451）作为MRF代表结构，其三维结构从PubChem数据库获取，NF-κB和TLR5的晶体结构从蛋白质数据库（PDB）下载，通过PyMOL和AutoDock工具进行对接分析。qPCR使用SYBR Green法，引物序列见附表。Western blot检测NF-κB p65及其磷酸化蛋白水平。结肠食糜微生物DNA提取后，对16S rRNA V3-V4区进行扩增和Illumina测序，使用QIIME和UPARSE进行OTU聚类。SCFA浓度采用离子色谱系统检测。数据使用GraphPad Prism 8.0.2进行单因素方差分析和Tukey多重比较，高通量数据经错误发现率（FDR）校正。

结果

3.1 MRF降低早期断奶腹泻

MRF组在ADG和ADFI上与CON组无显著差异，但在试验后14天降低了料重比（p=0.0439），腹泻发生率较CON组显著降低约50%，与ANT组相当（p=0.0041）。

3.2 改善肠道形态

MRF组空肠、回肠和结肠均未见显著炎症细胞浸润。与CON和ANT组相比，MRF显著增加回肠绒毛高度（p<0.01），提示营养吸收能力增强，空肠和结肠的绒毛高度及隐窝深度无组间差异。

3.3 提升结肠Roseburia丰度和丁酸盐浓度

MRF组Shannon指数高于ANT组（p<0.05），主坐标分析（PCoA）显示各组微生物群落结构明显分离。门水平上，MRF降低厚壁菌门、提高拟杆菌门比例；科水平上，增加普雷沃菌科和琥珀酸弧菌科，减少毛螺菌科、瘤胃球菌科和弯曲杆菌科；属水平上，MRF减少未分类毛螺菌科、弯曲杆菌、巨球形菌和脱硫弧菌，促进普雷沃菌科NK3B31群、未分类普雷沃菌科、琥珀酸弧菌、非排名普雷沃菌科、链球菌和Roseburia。值得注意的是，MRF富集了有益菌如普雷沃菌和Roseburia，抑制了潜在病原菌如弯曲杆菌。

SCFA测定显示，MRF显著提高结肠丙酸、戊酸和丁酸水平（p<0.05），其中丁酸浓度显著高于CON（p<0.01）和ANT（p<0.05），乙酸、异丁酸和异戊酸无组间差异。

3.4 MRF与膜受体TLR5结合并介导与NF-κB p65的相互作用

转录组分析显示CON与MRF组基因表达谱明显分离，PCA呈现清晰分组。热图和火山图显示SLC38A4、SLC25A34和TLR5基因上调，VSTM2L和TAC1下调。STRING网站预测TLR5的功能相关蛋白，分子对接表明MRF组分与TLR5复合物潜在结合能为-5.723 kcal·mol^-1。

3.5 通过调节TLR5/NF-κB通路减轻结肠炎症

MRF组TLR5表达显著上调（p<0.05），NF-κB信号负调控因子TNFAIP3（p<0.05）和NFKBIA（p<0.01）的mRNA水平升高，NFKB1和NFKB2转录本无变化。Western blot证实MRF降低NF-κB p65磷酸化（p<0.01），阻断其核转位。分子对接支持TLR5-NF-κB p65物理相互作用，抑制p65磷酸化。MRF降低IL-1β mRNA水平（p<0.05），对TNF-α和IL-6无显著影响。

讨论

本研究证明MRF通过调节肠道菌群组成和抑制TLR5/NF-κB通路炎症，有效缓解断奶仔猪腹泻。MRF促进回肠绒毛生长，富集丁酸盐产生菌如Roseburia，提升丁酸浓度，增强肠道屏障功能。TLR5/NF-κB信号轴作为MRF肠道健康益处的核心介质，将微生物调控与炎症减弱相联系，为改善仔猪健康提供了可持续的抗生素替代方案。

腹泻涉及胃肠道渗透压失衡和离子-水反向流动，促炎细胞因子失控释放破坏上皮离子转运和通透性。MRF减少弯曲杆菌定植，竞争性阻断病原体与肠上皮结合，提升细胞间连接强度加固屏障完整性。菌群分析显示MRF平衡厚壁菌门/拟杆菌门比例，降低促炎菌如弯曲杆菌和脱硫弧菌，富集有益菌如普雷沃菌和Roseburia。Roseburia能降解甘露聚糖产生丁酸，促进上皮再生和屏障功能，MRF通过益生元调节丁酸盐产生菌放大其抗炎效应。

MRF还具有免疫调节特性，减少大肠杆菌并下调TNF-α和TLR4表达，这些效应可能通过微生物重组间接调控免疫力。转录组分析发现TLR5信号上调，表明TLR5是MRF免疫代谢效应的潜在介质。TLR5信号轴是肠道免疫稳态调节因子，TLR5缺陷常与肠道炎症加剧和细菌易位相关。MRF提升Roseburia丰度和丁酸水平，同时诱导TLR5表达，提示MRF通过Roseburia来源的丁酸促进TLR5介导的免疫调节，揭示了一种新的碳水化合物驱动的免疫调控机制。

分子对接显示MRF的β-1,4-甘露聚糖主链以-5.723 kcal·mol^-1结合能结合NF-κB p65的LRR结构域，MRF还促进NF-κB p65与TLR5结合，可能通过甘露糖介导的桥接作用。TLR5-NF-κB相互作用抑制p65磷酸化和核转位，从而抑制下游炎症。MRF上调TNFAIP3（通过去泛素化负调控NF-κB）和NFKBIA（编码IκBα，将NF-κB滞留于胞质），这些效应与纤维代谢物抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）以及IκBα抑制NF-κB活化一致，共同支持MRF的抗炎机制。尽管当前计算和转录组证据强烈支持该机制，未来研究需通过TLR5敲除模型或类器官进行功能验证，以确立MRF在无抗或低抗生产系统中的有效性，并推进其在精准营养策略中的应用。

结论

本研究提出基于中和宿主炎症缓解仔猪断奶腹泻的新策略。MRF可能通过TLR5介导的NF-κB抑制缓解结肠炎症，有效支持断奶仔猪肠道健康。重要的是，MRF可替代抗生素维持肠道稳态，成为减少猪饲料中抗生素使用的可行选择。