NY-ESO-1通过招募去泛素化酶OTUB1稳定PP1α促进肿瘤细胞失巢凋亡抵抗和转移的新机制

本研究针对肿瘤转移关键环节——失巢凋亡抵抗机制展开探索，发现癌睾抗原NY-ESO-1通过招募去泛素化酶OTUB1形成三元复合物，抑制PP1α的K48多聚泛素化降解，增强ERK1/2信号通路活性，从而显著提升肿瘤细胞在悬浮状态下的存活能力和转移潜能。该研究不仅揭示了NY-ESO-1的非免疫原性生物学功能，更为靶向肿瘤转移提供了新的理论依据和治疗策略。

　　

癌症是全球死亡的主要原因，而转移是导致癌症患者死亡的首要因素。在肿瘤转移的多步骤过程中，脱离原发灶的肿瘤细胞能否在循环系统中存活是转移成功的关键。正常细胞在脱离细胞外基质或邻近细胞时会启动一种特殊形式的程序性死亡——失巢凋亡(anoikis)，但肿瘤细胞通过获得失巢凋亡抵抗能力，能够在脱离基质后继续存活，从而完成转移过程。然而，失巢凋亡抵抗的具体分子机制尚未完全阐明，针对这一过程的治疗药物也极为缺乏。

纽约食管鳞状细胞癌抗原1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1, NY-ESO-1)是一种典型的癌睾抗原(cancer-testis antigen, CTA)，通常在生殖细胞和胎盘细胞中表达，但在多种恶性肿瘤中重新表达，包括黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌和三阴性乳腺癌等。由于其表达模式相对局限且具有强免疫原性，NY-ESO-1一直被作为癌症免疫治疗的潜在靶点进行广泛研究。尽管NY-ESO-1靶向免疫疗法在临床前和临床试验中显示出良好的抗肿瘤效果，但这些疗法可能仅对一小部分患者有效，因为其对全身免疫状态较差的晚期癌症患者疗效有限。因此，直接靶向NY-ESO-1的生物学功能以控制肿瘤进展成为一种有吸引力的替代或补充治疗策略。然而，目前对NY-ESO-1生物学功能的理解仍十分有限。

发表在《Cell Death & Disease》的研究通过一系列实验证明，NY-ESO-1的表达与肿瘤患者的不良预后密切相关，特别是在免疫冷肿瘤中。研究人员发现，NY-ESO-1通过促进ERK1/2活化来抑制失巢凋亡，增强软琼脂集落形成能力，并促进小鼠肺转移。机制上，NY-ESO-1作为支架蛋白招募去泛素化酶OTUB1到PP1α，形成三元复合物，阻止PP1α的泛素化降解。研究强调OTUB1的去泛素酶活性（而非其抑制E2酶的能力）对于减少多聚泛素化和提高PP1α稳定性是必需的。最终，积累的PP1α蛋白显著激活下游ERK1/2信号。阻断ERK1/2或敲低PP1α能够拮抗NY-ESO-1介导的失巢凋亡抵抗。

研究采用的主要技术方法包括：利用Kaplan-Meier Plotter进行生物信息学分析肿瘤患者生存数据；通过慢病毒载体构建稳定过表达或敲低NY-ESO-1的细胞系；使用poly-HEMA涂层平板诱导失巢凋亡并通过FACS分析细胞死亡；软琼脂集落形成实验评估锚定非依赖性生长；免疫共沉淀和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定蛋白相互作用；蛋白质稳定性通过环己酰亚胺(CHX)追踪实验评估；体内实验采用NCG小鼠尾静脉注射肿瘤细胞建立肺转移模型。

NY-ESO-1表达与免疫冷肿瘤患者不良预后相关

通过生物信息学分析发现，NY-ESO-1高表达显著降低系统未治疗乳腺癌、肺癌、胃癌和骨髓瘤患者的生存率，但在卵巢癌和结肠癌中未见明显影响。进一步分析显示，在CD8低表达的免疫冷肿瘤亚组中，NY-ESO-1高表达显著降低卵巢癌和结肠癌患者的生存率，而在免疫热肿瘤中无此效应甚至有益。这表明NY-ESO-1可能通过免疫和非免疫途径共同促进肿瘤进展。

NY-ESO-1促进失巢凋亡抵抗、软琼脂集落形成和转移

实验表明，NY-ESO-1过表达并不影响肿瘤细胞增殖和迁移，但显著增强多种肿瘤细胞在悬浮条件下的存活能力，减少失巢凋亡。相反，敲低NY-ESO-1则显著增加悬浮细胞死亡。软琼脂集落形成实验证明NY-ESO-1过表达增加集落数量和大小，而敲低则减少集落形成。体内实验显示，敲低NY-ESO-1的A375黑色素瘤细胞在NCG小鼠中形成的肺转移灶显著减少，而过表达NY-ESO-1的MDA-MB-231细胞肺转移能力增强，且MEK抑制剂trametinib处理可完全阻断此效应。

NY-ESO-1通过激活ERK1/2抑制失巢凋亡

RNA测序分析显示NY-ESO-1过表达促进MAPK信号通路活化。免疫印迹证实NY-ESO-1过表达增加ERK1/2磷酸化水平，而敲低则降低其活性。在悬浮培养条件下，NY-ESO-1仍能维持ERK1/2活化。使用MEK抑制剂PD98059或trametinib处理可消除NY-ESO-1介导的失巢凋亡抵抗效应，表明ERK1/2活化是NY-ESO-1功能的关键介质。

NY-ESO-1通过减少多聚泛素化稳定PP1α

免疫共沉淀和质谱分析发现NY-ESO-1与蛋白磷酸酶1α(PP1α)相互作用。NY-ESO-1过表达延长PP1α半衰期，减少其K48多聚泛素化修饰；而敲低NY-ESO-1则促进PP1α泛素化降解。突变PP1α的泛素化位点(Lys-6、Lys-24和Lys-305)可减少其泛素化，且三重突变体(3KR)对NY-ESO-1的稳定作用不敏感。生物信息学分析显示PP1α高表达与胃癌、肺癌和结肠癌患者不良预后相关。

PP1α是NY-ESO-1介导ERK1/2活化和失巢凋亡抵抗的关键分子

PP1α敲低显著降低ERK1/2及其上游调控因子MEK1/2、B-Raf和C-Raf的活性。在NY-ESO-1过表达细胞中敲低PP1α可显著减弱ERK1/2活化，而在NY-ESO-1敲低细胞中过表达PP1α则可恢复ERK1/2活性。功能实验表明，PP1α敲低消除NY-ESO-1介导的失巢凋亡抵抗，而PP1α过表达可挽救NY-ESO-1敲低细胞的失巢凋亡敏感表型，且该效应依赖ERK1/2活化。

NY-ESO-1招募OTUB1促进PP1α去泛素化

质谱分析发现NY-ESO-1与多个去泛素化酶相互作用，其中OTUB1与NY-ESO-1和PP1α存在内源性结合。OTUB1敲低消除NY-ESO-1对PP1α的稳定作用，并逆转NY-ESO-1介导的失巢凋亡抵抗。机制上，OTUB1的去泛素酶活性（而非其E2结合能力）是减少PP1αK48多聚泛素化所必需的。催化失活突变体(C91S)无法恢复NY-ESO-1介导的PP1α稳定，而E2结合缺陷突变体(D88A)则仍具功能。

研究结论表明，NY-ESO-1通过招募OTUB1形成三元复合物，促进PP1α去泛素化和稳定，从而增强ERK1/2信号通路活性和失巢凋亡抵抗能力，最终促进肿瘤转移。这一发现不仅揭示了去泛素化酶底物拓展的新模式，而且突出了NY-ESO-1在肿瘤转移中的关键作用，为开发靶向NY-ESO-1的治疗策略提供了新的理论基础。研究表明，针对NY-ESO-1-PP1α-ERK信号轴可能成为预防肿瘤转移的有效策略，特别是对于NY-ESO-1阳性且免疫冷表型的肿瘤患者具有重要临床意义。