幽门螺杆菌通过超甲基化沉默HNF4A驱动胃癌发生的新机制：破坏上皮极性并激活EMT信号通路

本刊推荐：为解决幽门螺杆菌(Hp.)感染促胃癌机制不明的难题，研究人员开展HNF4A在胃癌中表达调控与功能机制的主题研究。发现HNF4A通过转录调控下游靶基因维持上皮极性并抑制EMT信号，Hp.感染通过诱导HNF4A启动子超甲基化使其沉默，进而破坏上皮极性并激活TGFβ诱导的EMT信号通路，最终驱动胃癌发生发展。该研究揭示了Hp.感染表观遗传调控的新机制，为胃癌防治提供了新靶点。

　　

胃癌是全球发病率第五、死亡率第五的恶性肿瘤，患者五年生存率仍不理想，主要原因是多数患者确诊时已处于晚期且发生转移。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp.)感染被世界卫生组织国际癌症研究机构列为I类致癌物，是胃癌发生的重要危险因素。约1%-3%的Hp.感染个体最终会发展为胃癌，其通过引起胃黏膜慢性炎症、萎缩和化生，最终导致癌前病变和癌症发生。虽然根除Hp.感染可降低胃癌风险，但Hp.感染促进胃癌发生发展的具体分子机制尚未完全阐明，尤其是Hp.感染如何激活上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition, EMT)信号通路仍不清楚。

EMT是上皮细胞失去极性、细胞间连接和黏附连接，获得间质细胞特性并具有浸润和迁移能力的重要生物学过程，被认为是肿瘤发生和转移的初始环节。除引起慢性炎症外，大量证据表明Hp.感染可激活胃上皮细胞的EMT信号通路，但具体机制有待揭示。Hp.感染可引起胃上皮细胞中大量基因异常表达，包括癌基因和抑癌基因，而表观遗传修饰尤其是DNA甲基化修饰是基因表达调控的重要方式。越来越多的证据显示Hp.感染可引起胃癌细胞全基因组DNA甲基化修饰模式的显著改变，特别是DNA超甲基化修饰。由于DNA甲基化修饰通常负向调控基因表达，Hp.感染沉默哪些抑癌基因值得深入研究。

肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor, HNF)家族是一类转录因子，包括HNF1A、HNF1B、HNF4A和HNF4G四个成员。HNF4A基因位于人类染色体20q13.12，包含12个外显子和11个内含子。既往研究表明HNF4A在结直肠癌、肾细胞癌和肝癌中通过转录调控下游靶基因发挥肿瘤抑制作用，但其在胃癌中的作用及调控机制尚不明确。

本研究通过免疫组化实验发现HNF4A蛋白在胃癌组织中明显下调，且与患者不良预后显著相关。生存分析显示HNF4A低表达患者总体生存时间较短，这一现象在肠型胃癌和弥漫型胃癌中均存在。基因表达分析显示HNF4A在年轻患者(≤50岁)、EBV阳性感染患者、全胃切除术患者、Borrmann IV期患者、病理III-IV期患者、T3&T4期患者和N2&N3期患者中表达较低。基于分子分型分析发现EMT亚型胃癌患者HNF4A表达最低，而MSS/TP53-亚型患者表达最高。

DNA甲基化分析显示HNF4A启动子区域包含12个CpG位点，这些位点的甲基化水平与HNF4A表达呈显著负相关。在11个胃癌细胞系中，5个细胞系(SNU-638、SNU-484、MKN74、NUGC-3和AZ-521)在HNF4A启动子区域cg23834593 CpG位点高甲基化，相应HNF4A表达几乎检测不到。使用DNA甲基转移酶抑制剂(5-Aza,10μM;5-Aza-CdR,10μM)处理可重新激活MKN74和HGC-27细胞系中HNF4A的表达。两个独立数据集(GSE30601和GSE85464)的甲基化分析均显示胃癌组织中HNF4A启动子DNA甲基化水平显著上调。

研究发现Hp.感染与HNF4A表达下调密切相关。免疫组化显示Hp.感染阳性胃癌患者HNF4A蛋白表达较低，TCGA_STAD和GSE62254队列分析也表明Hp.感染阳性患者HNF4A mRNA表达显著下调。体外实验显示Hp.感染以时间依赖性方式降低正常胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞AGS中HNF4A的表达。全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)证实Hp.感染导致GES-1和AGS细胞系中HNF4A基因启动子甲基化修饰显著增加。体内分析显示Hp.阴性、既往Hp.感染和Hp.阳性患者的胃黏膜组织中，HNF4A启动子DNA甲基化在既往感染和阳性感染样本中均显著增加。

功能实验表明HNF4A在胃癌中发挥肿瘤抑制作用。在HNF4A高表达的SNU-16和AGS细胞系中进行敲减，在低表达的MKN-74和NUGC-3细胞系中进行过表达，CCK8和细胞克隆形成实验显示HNF4A过表达显著抑制胃癌细胞系增殖能力，而敲减则加速细胞增殖。Transwell侵袭实验表明HNF4A负向调控胃癌细胞系侵袭能力。裸鼠移植瘤实验显示HNF4A过表达使肿瘤重量和体积减小，免疫组化显示Ki-67表达降低。尾静脉转移实验证实HNF4A过表达抑制胃癌细胞肺转移率和转移灶数量。

机制研究表明HNF4A通过转录调控下游靶基因维持上皮细胞极性。RNA测序发现HNF4A过表达后显著上调DNAJC22、USH1C、HGD、MYO15B、MUC13、EPS8L3、MYO1A、CREB3L3和ALPI等基因表达。基因本体(GO)分析显示HNF4A正调控基因富集于肌动蛋白细胞投射、刷状缘和顶端质膜等术语。单细胞RNA测序分析显示HNF4A及其诱导的下游靶基因选择性表达于上皮细胞，与上皮生物标志物正共表达，与间质生物标志物负共表达。

研究发现HNF4A转录抑制TGFB1基因表达。RNA测序显示HNF4A对EMT诱导因子TGFB1表达有明显抑制作用。qRT-PCR和Western blot验证HNF4A负向调控TGFB1表达。ELISA实验显示HNF4A过表达降低可溶性TGFβ水平，敲减则增加其水平。JASPAR网站预测发现TGFB1基因启动子包含两个HNF4A结合位点，CHIP-qPCR实验证实HNF4A可识别这两个 motif，双荧光素酶报告基因实验证明这两个 motif对HNF4A负调控TGFB1表达至关重要。

最后研究证实HNF4A沉默是Hp.感染激活EMT信号所必需的。研究发现Hp.感染只能在HNF4A高表达的胃癌细胞系中诱导EMT信号，而在低表达的MKN74细胞系中无显著影响。构建使用泛素基因启动子的HNF4A过表达AGS细胞系，发现Hp.感染可显著激活内源性HNF4A表达细胞系的EMT信号，而不能诱导外源性HNF4A过表达细胞系的EMT信号。

本研究主要采用了以下关键技术方法：基于48对胃癌组织的免疫组化分析、TCGA_STAD和GSE62254等多队列生物信息学分析、全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)、体外细胞感染模型、基因敲减和过表达功能实验、RNA测序和生物信息学分析、染色质免疫沉淀(ChIP)和双荧光素酶报告基因实验、裸鼠移植瘤和肺转移模型等。

HNF4A下调与胃癌不良预后相关

通过免疫组化实验发现HNF4A蛋白在胃癌组织中明显下调，且肠型胃癌中的表达显著高于弥漫型胃癌。生存分析显示HNF4A低表达患者预后较差，TCGA_STAD队列分析也证实这一现象。基因表达分析显示HNF4A在年轻患者、EBV阳性患者、全胃切除术患者、晚期患者中表达较低，EMT亚型患者表达最低。

HNF4A表达受其启动子DNA超甲基化负调控

生物信息学分析显示HNF4A启动子12个CpG位点甲基化水平与表达呈负相关。实验证实DNA甲基转移酶抑制剂可重新激活胃癌细胞系中HNF4A表达。两个独立数据集显示胃癌组织中HNF4A启动子DNA甲基化水平显著上调。

Hp.感染通过DNA超甲基化抑制HNF4A表达

临床样本分析显示Hp.感染阳性患者HNF4A表达较低。体外实验表明Hp.感染以时间依赖性方式降低HNF4A表达。WGBS证实Hp.感染导致HNF4A基因启动子甲基化增加。体内分析显示Hp.感染患者胃黏膜组织HNF4A启动子DNA甲基化显著增加。

HNF4A在胃癌中发挥肿瘤抑制作用

功能实验表明HNF4A过表达抑制胃癌细胞增殖和侵袭能力，敲减则促进增殖和侵袭。动物实验证实HNF4A过表达抑制移植瘤生长和肺转移。

HNF4A参与维持上皮细胞极性

RNA测序发现HNF4A调控多个上皮极性相关基因表达。单细胞分析显示HNF4A选择性表达于上皮细胞。表达相关性分析显示HNF4A与上皮标志物正相关，与间质标志物负相关。

HNF4A转录抑制TGFB1基因表达

研究发现HNF4A负向调控TGFB1表达。机制研究表明HNF4A通过结合TGFB1启动子两个 motif直接抑制其转录。

HNF4A沉默是Hp.感染激活EMT信号所必需

实验证实Hp.感染只能在HNF4A高表达细胞中诱导EMT，在低表达细胞中无此效应。外源HNF4A过表达可逆转Hp.感染对EMT信号的激活作用。

本研究结论表明HNF4A是胃癌中的肿瘤抑制基因，其下调与恶性进展和不良预后相关。研究发现HNF4A通过转录调控下游靶基因维持上皮极性和抑制EMT信号发挥抑癌作用。更重要的是，研究揭示了Hp.感染通过引起HNF4A基因启动子超甲基化导致其沉默，进而破坏上皮极性并诱导胃上皮细胞EMT信号通路激活，最终驱动胃癌发生和转移的分子机制。

讨论部分指出，胃癌是多阶段、多步骤的渐进性病理过程，伴随基因表达的显著变化。肿瘤驱动基因在促进癌变或转移中起重要作用，靶向驱动基因对克服癌症更有益。本研究不仅证实HNF4A在胃癌中的抑癌作用，还阐明其通过逆转EMT抑制胃癌进展的机制。研究发现Hp.感染和EBV感染均与HNF4A低表达相关，这与胃癌中极高甲基化表型一致。研究强调了HNF4A沉默对Hp.感染激活EMT信号的必要性，为理解Hp.感染促胃癌机制提供了新视角。

该研究的重要意义在于揭示了Hp.感染表观遗传调控的新机制，发现了HNF4A作为胃癌抑制基因的关键作用，阐明了Hp.-HNF4A-EMT轴在胃癌发生发展中的分子通路，为胃癌防治提供了新的潜在靶点和策略。