ROCK激酶抑制剂靶向干预脉络膜新生血管诱发视网膜下纤维化的机制研究

《Cell Death Discovery》：Rho-kinase inhibition reduces subretinal fibrosis

本研究针对抗VEGF疗法疗效有限的年龄相关性黄斑变性(AMD)继发视网膜下纤维化难题，通过ROCK抑制剂(fasudil/belumosudil)干预小鼠模型，结合成像质谱流式(IMC)等技术证实：靶向RhoA/ROCK信号通路可显著降低TGF-β1、α-SMA等纤维化标志物表达，有效抑制细胞外基质(ECM)重塑。为临床抗纤维化治疗提供了新策略。

　　

在年龄相关性黄斑变性(AMD)的病理进程中，脉络膜新生血管(CNV)引发的视网膜下纤维化是导致视力不可逆损伤的关键因素。尽管抗血管内皮生长因子(VEGF)疗法能有效抑制血管增生，但对已形成的纤维化瘢痕却收效甚微。这种纤维化病变的本质是视网膜色素上皮(RPE)细胞、胶质细胞等通过上皮-间质转化(EMT)转化为肌成纤维细胞，过度分泌胶原蛋白等细胞外基质(ECM)成分，最终破坏视网膜正常结构。因此，开发特异性靶向纤维化进程的治疗策略成为眼科领域亟待突破的难题。

发表于《Cell Death Discovery》的这项研究创新性地聚焦于Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路。该通路通过调控肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化等机制，直接参与细胞收缩、迁移及纤维化激活过程。研究人员分别采用非选择性ROCK抑制剂fasudil和选择性ROCK2抑制剂belumosudil，在激光诱导的CNV小鼠模型中系统评估了其对视网膜下纤维化的干预效果。

研究团队首先通过体外实验验证了两种抑制剂对人真皮成纤维细胞(HDF)和小鼠成纤维细胞(MC3T3)的作用。免疫组化显示，经24小时干预后，细胞内ROCK1/2表达显著降低，且MC3T3细胞形态由不规则三角形向钝化菱形转变，细胞数量明显减少(p<0.0001)，提示ROCK抑制剂可直接抑制成纤维细胞活化。

在体内实验中，研究人员通过建立精准的干预时间窗（激光后35天开始给药），有效排除了活动性CNV对疗效评估的干扰。多模态影像学监测发现，与对照组相比，fasudil组和belumosudil组在49天时病灶体积分别降至4.1×10⁷μm³(p<0.05)和2.7×10⁷μm³(p<0.0001)，纤维化体积也显著减小至2.9×10⁴μm³(p<0.01)和2.7×10⁴μm³(p<0.001)。组织学分析进一步证实，治疗组视网膜层次结构保存更完整，Ⅰ型胶原和α-SMA阳性区域面积分别从11.89%降至5.11%(p<0.01)和12.76%降至7.12%(p<0.0001)。

Western blot结果揭示了分子层面的作用机制：两种抑制剂均能显著降低脉络膜-RPE复合体中p-MYPT1、TGF-β₁、纤维连接蛋白等关键纤维化标志物的表达水平(p<0.05)。尤为重要的是，研究首次应用成像质谱流式(IMC)技术对视网膜细胞群体进行空间解析，发现belumosudil能更有效地减少巨噬细胞浸润(p<0.05)和脉络膜-RPE区域的纤维化标记物阳性细胞数量，提示ROCK2选择性抑制可能具有更精准的抗纤维化优势。

技术方法层面，研究采用532nm氩激光建立C57BL/6小鼠CNV模型，通过眼底自发荧光(AF)、荧光血管造影(FA)和光学相干断层扫描(OCT)进行纵向评估；使用重金属同位素标记抗体结合Hyperion成像系统进行IMC分析；通过Western blot、免疫组化等技术量化纤维化相关蛋白表达。

纤维化特征表征

人真皮成纤维细胞和小鼠成纤维细胞的实验表明，ROCK抑制剂处理能显著降低ROCK1/2的细胞内定位和表达水平，并诱导成纤维细胞形态改变与数量减少，证实其对纤维化核心细胞具有直接调控作用。

纤维化重塑的免疫组织学评估

多时间点影像学监测显示，ROCK抑制剂干预后病灶体积和纤维化程度显著改善。组织染色证实治疗组视网膜结构保存更好，Ⅰ型胶原和α-SMA表达显著降低，表明ROCK抑制能有效延缓纤维化进程。

纤维化标志物的Western Blot验证

蛋白质印迹分析显示，fasudil和belumosudil均能显著下调p-MYPT1、TGF-β₁、纤维连接蛋白等纤维化相关因子表达，从分子层面证实ROCK信号通路在纤维化中的核心地位。

IMC细胞类型分类与空间聚类

成像质谱流式技术首次揭示视网膜纤维化微环境中各类细胞的分布变化，发现belumosudil能特异性减少巨噬细胞等炎症细胞浸润，为理解其靶向治疗机制提供了单细胞分辨率证据。

讨论部分提出了"纤维化生态位"的创新概念，认为纤维化区域存在由成纤维细胞、EMT转化RPE细胞等构成的异质性群体。研究指出ROCK2选择性抑制剂belumosudil通过调控TGF-β₁/Smad通路，更精准地抑制肌成纤维细胞分化和ECM沉积，且对巨噬细胞等炎症细胞的调节作用优于非选择性抑制剂。

该研究不仅证实ROCK抑制剂作为AMD继发视网膜下纤维化治疗策略的可行性，更通过高分辨率细胞图谱揭示了纤维化微环境的动态演变规律。特别是belumosudil展现的靶向性优势，为临床开发兼具疗效与安全性的抗纤维化药物提供了重要理论依据。未来结合单细胞测序等技术的深入探索，有望进一步阐明纤维化细胞起源，推动个体化治疗策略的发展。