柴胡皂苷-D通过靶向PIM1/c-Myc轴重编程致癌选择性剪接诱导癌细胞死亡

《Cell Death Discovery》：Saikosaponin?D triggers cancer cell death by targeting the PIM1/c-Myc axis to reprogram oncogenic alternative splicing

本研究针对不同柴胡皂苷(SSs)抗肿瘤活性及机制不清的问题，聚焦SSD通过直接靶向PIM1激酶，阻断PIM1与Myc相互作用，降低c-Myc蛋白Ser62位点磷酸化及稳定性，进而抑制Myc转录活性，调控选择性剪接因子网络，重编程CYP1A1等致癌剪接变异体表达。研究证实SSD在胃癌、前列腺癌等多癌种中显著抑制肿瘤生长，为传统中药活性成分抗肿瘤机制提供了新颖的PIM1/Myc/剪接轴理论依据。

　　

在传统中药宝库中，柴胡（Radix Bupleuri）作为应用两千余年的经典药材，其抗肿瘤功效一直备受关注。柴胡皂苷（Saikosaponins, SSs）作为主要活性成分，虽已被证实具有广谱抗肿瘤潜力，但具体哪种皂苷成分效力最强、如何作用于癌细胞、其分子靶点是什么等关键问题，始终笼罩在迷雾之中。尤其值得注意的是，选择性剪接（alternative splicing）作为真核生物基因表达调控的关键环节，其异常与肿瘤发生发展密切相关，但中药成分能否通过调控这一过程发挥抗肿瘤作用，仍是未被深入探索的领域。

针对这一空白，张欣、李雪辉等研究人员在《Cell Death Discovery》上发表了最新成果。他们系统比较了SSA、SSB1、SSB2、SSC和SSD五种主要柴胡皂苷的抗肿瘤效果，意外发现SSD在胃癌、前列腺癌和结直肠癌等多种癌细胞模型中展现出最显著的生长抑制能力。进一步实验表明，低剂量SSD即可有效抑制癌细胞迁移和侵袭，并在患者来源的胃癌类器官（patient-derived organoids, POs）中验证了其诱导癌细胞死亡的效果。

为了揭开SSD的作用谜底，团队进行了转录组测序（RNA-seq）分析。结果提示，SSD处理后显著下调的基因富集于剪接体（spliceosome）和mRNA剪接相关通路，并引发了超过一千个差异性调节剪接事件（differentially regulated splicing events, DRSEs），其中外显子跳跃（skipped exon, SE）类型占比超过70%。深入研究显示，SSD显著改变了细胞色素P450家族1亚家族A成员1（CYP1A1）基因的剪接模式，下调其转录本1和2的表达，同时上调转录本3。临床数据关联分析发现，CYP1A1高表达与胃癌患者不良预后相关。利用CRISPR-Cas13d技术特异性敲低CYP1A1的不同剪接变异体后，发现敲低转录本1/2能模拟SSD的抑癌效果，而敲低转录本3则影响甚微，且敲低转录本1/2后癌细胞对SSD的敏感性下降，这证实了CYP1A1的剪接重编程是SSD抑癌的重要环节。

机制探索层面，研究人员发现SSD下调的多个剪接因子是原癌基因Myc的转录靶标。SSD虽不影响MYC的mRNA水平，却能降低c-Myc蛋白总量及其Ser62位点磷酸化（p-Myc^Ser62）水平，缩短c-Myc蛋白半衰期。使用Myc转录抑制剂KJ-Pyr-9可模拟SSD对剪接因子及CYP1A1剪接的调控作用，并削弱SSD的抑癌效果，说明SSD通过影响Myc活性调控剪接。

那么，SSD是如何影响Myc的呢？通过SwissTargetPrediction等数据库靶点预测及蛋白互作（protein-protein interaction, PPI）分析，研究人员将目光锁定于丝氨酸/苏氨酸激酶PIM1。分子对接模拟显示，SSD通过Arg-6和Val-126等关键氨基酸残基与PIM1高亲和力结合，且结合力优于其他SSs。细胞热转移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）和蛋白免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）实验证实，SSD能在细胞内直接结合PIM1，并破坏PIM1与c-Myc之间的相互作用。使用PIM1抑制剂SGI-1776能再现SSD对c-Myc蛋白水平、剪接因子表达及癌细胞生长的抑制效应，且联合用药时SSD的增效作用减弱，表明PIM1是SSD上游的关键直接靶点。

体内实验进一步佐证了SSD的抗肿瘤潜力。在HGC-27细胞构建的裸鼠移植瘤模型中，腹腔注射SSD（10 mg/kg）能显著抑制肿瘤生长，且未引起小鼠体重显著变化或主要器官的明显病理损伤。肿瘤组织免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）分析显示，SSD处理组肿瘤细胞增殖标志物Ki67阳性率降低，c-Myc和p-Myc^Ser62蛋白水平也显著下降，与体外实验结果一致。血液生化指标分析表明SSD在该剂量下未产生明显肝肾毒性或血液学毒性。

研究采用的关键技术方法

本研究综合利用了细胞活力检测（CCK-8法）、划痕愈合、Transwell小室、3D Matrigel培养等技术评估SSD对癌细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用；通过转录组测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA）筛选SSD调控的基因及通路；采用CRISPR-Cas13d系统进行基因转录本特异性敲低；利用患者来源的胃癌类器官（PDOs）模型进行药效验证；通过分子对接、CETSA、Co-IP等技术验证SSD与靶蛋白PIM1的直接相互作用；并最终在裸鼠移植瘤模型上评估了SSD的体内抗肿瘤活性及安全性。

SSD suppresses cancer cell and organoid growth activity in different cancer types

通过比较五种主要柴胡皂苷对九种癌细胞模型生长的抑制作用，发现SSD在不同癌种中均表现出最强的抗肿瘤效果，且呈剂量依赖性。低剂量SSD在不明显抑制细胞生长的前提下，即可显著抑制癌细胞迁移和侵袭。在来自胃癌患者的类器官模型中，低剂量SSD也能有效诱导癌细胞死亡。

SSD decreases alternative splicing factors and rewires alternative splicing

转录组分析揭示，SSD处理导致超过200个基因差异表达，其中下调基因显著富集于剪接体和mRNA剪接相关通路。SSD引发了超过一千个差异性剪接事件，以外显子跳跃为主。代表性基因（如SERPINB2、KRT13）的可视化分析证实了剪接模式的改变。

Manipulation of SSD-induced CYP1A1 splicing variants suppresses cancer growth

SSD处理显著改变了CYP1A1基因的剪接模式，下调其转录本1和2，上调转录本3。利用CRISPR-Cas13d特异性敲低CYP1A1的不同转录本发现，敲低转录本1/2能抑制癌细胞生长，而敲低转录本3影响不大。敲低转录本1/2后，癌细胞对SSD的敏感性降低，表明SSD通过调控CYP1A1剪接发挥抑癌作用。

SSD treatment restrains Myc transcription activity on alternative splicing factors

SSD下调的多个剪接因子是Myc的转录靶标，且在癌症组织中高表达与患者不良预后相关。SSD处理降低了c-Myc蛋白总量、p-Myc^Ser62水平及其蛋白稳定性，但不影响MYC mRNA表达。抑制Myc转录活性可模拟SSD对剪接因子和CYP1A1剪接的调控，并削弱SSD的抑癌效果。

SSD binds to PIM1 and decreases PIM1-mediated Myc phosphorylation

靶点预测和分子对接表明SSD可直接高亲和力结合PIM1激酶。CETSA和Co-IP实验证实SSD在细胞内结合PIM1并破坏PIM1-Myc相互作用。SSD处理不影响PIM1的表达，但使用PIM1抑制剂可模拟SSD对c-Myc、剪接因子及癌细胞生长的抑制效应，并削弱SSD的增效作用。

SSD treatment suppresses cancer growth in the xenografted mouse model

在裸鼠移植瘤模型中，SSD给药显著抑制了肿瘤生长，降低了肿瘤组织中Ki67阳性率以及c-Myc和p-Myc^Ser62的水平，且未引起明显的全身毒性或器官病理损伤，证实了SSD在体内的有效性和安全性。

综上所述，本研究首次系统比较了主要柴胡皂苷的抗肿瘤活性，确立了SSD的核心地位，并深入揭示了其通过直接靶向PIM1，破坏PIM1-Myc相互作用，降低c-Myc蛋白稳定性及转录活性，进而全局性调控致癌剪接因子网络，重编程选择性剪接（如CYP1A1），最终诱导癌细胞死亡的全新分子通路（PIM1/c-Myc/剪接轴）。该研究不仅阐明了中药活性成分SSD的高效抗肿瘤分子机制，为柴胡的抗肿瘤应用提供了精准的药理学依据，更重要的是，为难以直接靶向的癌基因Myc提供了一种通过调控其上游激酶PIM1间接抑制其活性的新颖策略，并拓展了天然产物调控选择性剪接在癌症治疗中的应用前景。未来，针对PIM1/Myc轴或其调控的特定致癌剪接事件，可能发展成为有潜力的癌症治疗新途径。