生物信息学驱动设计最小仿生金属结合肽：实现漆酶三核铜位点功能模拟

为解决可持续能源催化剂设计难题，研究人员开发了MetalSite-Analyzer(MeSA)生物信息学工具，基于漆酶(laccase)三核铜位点设计出八肽H4pep(HTVHYHGH)。该肽与Cu2+形成稳定的β-折叠结构复合物，具有O2还原催化活性，为最小功能位点(MFS)仿生催化剂设计提供了新范式。

　　

随着全球对可持续能源需求的日益增长和气候危机的加剧，开发高效储存和生产可再生能源的装置成为当务之急。自然界经过数十亿年进化优化出的酶结构，为催化特定化学反应提供了完美蓝图。其中，金属酶因其能够驱动可再生能源转换关键反应而成为人工催化剂开发的重要模型库。然而，天然酶存在化学稳定性差、工艺性受限等问题，而完全合成催化剂又面临合成复杂的挑战。

在这项发表于《Communications Chemistry》的研究中，研究人员开创性地采用生物信息学方法，设计出能够模拟漆酶三核铜位点功能的最小肽段。漆酶作为多铜氧化酶家族成员，能够催化多种有机底物的一电子氧化，同时耦合氧气的四电子还原生成水。其活性中心的三核铜簇（2型/3型铜位点）是氧气还原的关键部位，也成为本研究的设计蓝本。

研究团队首先开发了MetalSite-Analyzer(MeSA)生物信息学工具，该工具能够从蛋白质数据库(PDB)结构中提取金属位点的最小功能位点(MFS)信息，通过PSI-BLAST分析序列保守性，识别对金属结合和功能至关重要的氨基酸残基。基于漆酶(PDB ID: 3tbc)三核铜位点的分析，研究人员设计出仅含8个氨基酸的最小肽段H4pep(序列：HTVHYHGH)。

关键技术方法包括：1）MeSA生物信息学工具进行金属结合位点保守性分析；2）固相肽合成(SPPS)制备H4pep肽段；3）圆二色光谱(CD)分析二级结构；4）紫外-可见光谱和电子顺磁共振(EPR)研究金属结合特性；5）电化学方法（循环伏安法、计时安培法）评估氧还原催化活性；6）核磁共振(NMR)研究溶液结构；7）密度泛函理论(DFT)计算优化结构。

Bioinformatic tool and peptide design

通过MeSA工具分析，研究人员从漆酶三核铜位点中提取出四个金属结合片段，这些片段共同组成了具有C2对称性的β-折叠结构。选择两个最短片段（7-9个氨基酸）进行序列保守性分析，最终设计出包含保守组氨酸结合模体的八肽H4pep。

Binding of metal ions by H4pep

光谱学研究证实H4pep能够有效结合Cu²⁺和Cu⁺。紫外-可见光谱显示特征性酪氨酸吸收峰随铜添加而变化，竞争性滴定实验测得H4pep与Cu⁺的解离常数K_D=2.4×10^-12M。NMR研究表明锌和铜结合主要发生在组氨酸侧链。

Secondary structure and pH dependence of metal binding

CD光谱显示，apo-H4pep在溶液中呈无规卷曲构象，加入Cu²⁺后诱导形成β-折叠结构，在227nm处出现负峰和210nm处正峰。这种构象变化具有pH依赖性，在pH5.2和5.6时最明显，符合组氨酸咪唑基团pK_a≈6的特性。

Titration experiments via EPR

EPR谱显示存在至少两种不同的H4pep-Cu²⁺物种。在肽过量条件下观察到单一轴向信号，而在较高铜浓度下出现第二个轴向信号，表明第二个Cu²⁺离子的配位导致局部环境微小扭曲。

Stoichiometry of H4pep-Cu²⁺ complexes

光谱数据拟合表明形成了Cu²⁺_x(H4pep)₂复合物，包括1Cu2Pep（单铜双肽）和2Cu2Pep（双铜双肽）两种物种。动态光散射实验证实即使在高铜浓度下也不形成大分子聚集体。

Electrochemistry and testing of activity

电化学研究表明1Cu2Pep在-0.20V（vs Ag/AgCl）下表现出氧还原催化活性，计时安培法显示稳态电流约-15μA，同时Clark电极检测到氧气浓度下降。对照实验排除了游离铜物种的贡献。

研究结论表明，MeSA工具能够有效指导仿生催化活性金属肽的设计。H4pep-Cu²⁺复合物形成稳定的β-折叠结构，重现了漆酶活性位点的关键特征。虽然目前催化活性较天然漆酶仍较微弱，但这项工作证明了使用短肽模拟天然酶最小功能位点的可行性和潜力。这种设计策略为研究结构-功能关系提供了可控的模块化平台，在仿生催化、生物能源转换等领域具有重要应用前景。

值得注意的是，这是首例在溶液中稳定且具有催化活性的合成β-折叠金属肽复合物。研究方法避免了β-折叠结构常见的聚集和原纤维形成问题，通过金属配位实现了可控自组装。该工作不仅推动了仿生催化剂设计领域的发展，也为理解金属介导的肽组装机制提供了分子水平的见解，对神经退行性疾病中淀粉样β聚集体的研究也具有参考价值。