HOIL-1通过非经典线性泛素化途径稳定HBx蛋白促进乙肝相关肝癌进展的机制研究

本研究针对乙肝病毒（HBV）相关肝细胞癌（HCC）中线性泛素链组装复合体（LUBAC）的作用机制不明确的问题，通过多组学分析发现HOIL-1（RBCK1）亚基在HBV-HCC中特异性高表达且与不良预后相关。研究人员采用基因敲降、动物模型和分子互作实验，揭示HOIL-1通过招募去泛素化酶USP15减少HBx蛋白的K48连接泛素化降解，从而增强其稳定性并促进肿瘤恶性进展。该发现为HBV-HCC提供了独立于LUBAC酶活性的新治疗靶点，具有重要临床转化价值。

　　

在全球癌症负担中，肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）位居癌症相关死亡原因的第二位，而乙肝病毒（Hepatitis B Virus, HBV）感染是其最主要的致病因素。尽管新生儿预防接种和抗病毒治疗已取得显著成效，HBV仍然是全球HCC发生的首要风险因素，构成严峻的公共卫生挑战。乙肝X蛋白（HBx）已被证实是病毒复制的关键调节因子，同时它通过调控基因转录、细胞内信号转导、基因毒性应激反应、蛋白降解、细胞周期和凋亡等过程，成为HBV相关HCC（HBV-HCC）的重要致癌驱动因子。值得注意的是，HBx是一种不稳定蛋白，可通过泛素-蛋白酶体途径快速降解，维持细胞内低水平表达，但其在致癌过程中维持稳定性的具体机制尚不明确。

泛素化作为一种重要的翻译后修饰，调控包括细胞周期进程、DNA损伤应答、基因转录、受体转运和蛋白稳定性在内的多种细胞过程。线性泛素链（Met1连接的多泛素化，M1-Ubi）是通过泛素N端甲硫氨酸（Met1）的α-氨基与另一个泛素C端甘氨酸的羧基之间形成肽键而组装成的。线性泛素链组装复合体（Linear Ubiquitin Chain Assembly Complex, LUBAC）是目前已知唯一能够特异性组装线性泛素链的E3泛素连接酶，由HOIL-1（又称RBCK1）、HOIP（RNF31）和SHARPIN三个亚基组成。其中HOIP负责催化线性泛素链的组装，而HOIL-1和SHARPIN作为辅助蛋白，通过其泛素样结构域与HOIP的泛素结合结构域相互作用，形成稳定复合体。LUBAC参与的生物学功能包括免疫信号传导、小鼠发育、蛋白质质量控制、Wnt信号和自噬等。尽管越来越多的证据表明LUBAC组分及其介导的M1-Ubi与癌症进展相关，但其在HBV-HCC中的调控机制仍不清楚。

在这项发表于《Experimental & Molecular Medicine》的研究中，研究人员通过系统的实验分析，揭示了LUBAC组分HOIL-1在HBV-HCC中通过非经典方式稳定HBx蛋白并促进肿瘤进展的新机制。研究团队首先发现LUBAC组分及M1-Ubi在HCC组织中显著上调，且与患者不良预后相关。然而，使用LUBAC活性抑制剂HOIPIN-1处理并不能影响HCC细胞的恶性表型或其对索拉非尼治疗的敏感性，提示LUBAC可能通过不依赖其酶活性的方式促进HCC进展。进一步分析显示，在HBV-HCC中，只有HOIL-1（而非HOIP或SHARPIN）特异性上调，且其高表达与肿瘤大小、甲胎蛋白（AFP）水平升高及患者预后不良显著相关。

为了深入探索HOIL-1的功能，研究团队应用了多种关键技术方法：他们利用临床样本队列（包括147例石蜡包埋的HCC标本）进行免疫组化和生存分析；通过体外基因敲降和过表达实验，结合CCK-8、EdU掺入、Transwell和肿瘤球形成等功能实验；构建了DEN/CCl₄诱导的小鼠HCC模型和皮下移植瘤模型，并采用腺相关病毒（AAV9）介导的体内基因敲降；运用RNA测序、染色质免疫沉淀（ChIP）、共免疫沉淀（Co-IP）、泛素化分析和蛋白质稳定性实验等分子机制研究手段。

研究结果主要包括以下几个方面：

HOIL-1表达上调与HCC进展及不良预后相关

通过分析TCGA、GEO和自有队列数据，发现HOIL-1在HCC组织中mRNA和蛋白水平均显著上调，且其高表达与患者总体生存期和无病生存期缩短相关。值得注意的是，这种关联在HBV感染的HCC患者中尤为明显。

靶向HOIL-1抑制HCC进展

体外实验表明，敲低HOIL-1表达显著抑制HBV-HCC细胞（如HepG2.2.15）的增殖、迁移和肿瘤干细胞特性，而HOIL-1过表达则产生相反效应。在DEN/CCl₄诱导的小鼠HCC模型中，AAV9介导的HOIL-1敲降显著减轻了肿瘤负荷。

HOIL-1特异性在HBV-HCC中上调

分析公共数据集和自有临床样本发现，HOIL-1（而非HOIP或SHARPIN）在HBV-HCC组织中特异性高表达。在HBV小鼠模型中，也观察到肝脏HOIL-1蛋白水平升高。

HOIL-1促进HBx蛋白稳定性

机制研究表明，HOIL-1与HBx蛋白（而非其他HBV蛋白）直接相互作用，并通过招募去泛素化酶USP15减少HBx的K48连接泛素化，从而抑制其蛋白酶体降解途径，增强HBx蛋白稳定性。

临床相关性分析

临床样本分析显示，HOIL-1与HBx表达水平呈正相关，且HOIL-1高表达仅在与USP15高表达共存的HBV-HCC患者中预示不良预后。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次揭示了LUBAC组分HOIL-1在HBV-HCC中通过不依赖线性泛素化的非经典功能，直接与HBx相互作用并招募USP15去泛素化酶，减少HBx的K48连接泛素化降解，从而增强其稳定性和致癌活性。这一发现不仅深化了对HBV相关肝癌发病机制的理解，而且为开发针对HOIL-1-HBx相互作用界面的靶向治疗策略提供了理论依据。由于直接抑制HOIL-1酶活性面临技术挑战，针对该蛋白互作界面的小分子抑制剂或肽模拟物可能成为治疗HBV-HCC的新途径。该研究为HBV相关肝癌的精准治疗提供了潜在的生物标志物和治疗靶点，具有重要的临床转化意义。