三维心脏成像整合电生理揭示致心律失常性心肌病的纤维化低频滤波机制

《Nature Cardiovascular Research》：Correlative imaging integrates electrophysiology with three-dimensional murine heart reconstruction to reveal electrical coupling between cell types

本刊推荐：为解决心脏纤维化导致电传导紊乱的机制难题，研究人员开发了相关性成像方法，整合宏观电生理与三维微观心脏重建。研究发现纤维化区域表现出频率依赖性传导行为，高频刺激时传导失败并促进折返性心律失常。该机制由结构数据驱动的计算模型定量解释，为致心律失常性心肌病(ACM)提供了新的病理机制见解。

　　

在心脏疾病研究领域，心肌纤维化与电传导紊乱之间的关联早已被临床证实，但其具体作用机制始终迷雾重重。特别是致心律失常性心肌病(Arrhythmogenic Cardiomyopathy, ACM)，作为一种与纤维化重塑密切相关的遗传性心脏病，已成为压力相关性心律失常性猝死的主要原因，然而科学家们至今未能完全阐明纤维化组织如何干扰心脏电信号传导的具体机制。这一认知缺口严重阻碍了我们对心脏电生理学和心律失常发生的预测能力。

传统上，心脏疤痕组织通常被视为完全无传导功能的"死"组织，但近年来的研究表明，纤维化病变实际上是高度动态的组织，不仅包含存活的心肌细胞束或岛，还含有相当数量的非心肌细胞，这些细胞已知能与心肌细胞支持电紧张交叉对话。这种复杂性使得阐明纤维化组织对心律失常发生的影响需要一种综合方法，将心脏细胞和细胞外基质结构组织的详细重建与纤维化组织环境内外电生理特性的全面评估相结合。

正是在这样的研究背景下，国际研究团队在《Nature Cardiovascular Research》杂志上发表了创新性研究成果，通过开发一种全新的相关性成像方法，成功将宏观心脏电生理学与心室的三维微尺度重建相整合，为揭示纤维化与电生理改变之间的联系机制提供了前所未有的见解。

研究人员主要运用了几项关键技术：通过光学映射技术量化离体Langendorff灌流心脏的动作电位形态和传导动力学；利用优化的SHIELD组织透明化协议处理样本；采用基于mesoSPIM的高通量光片介观显微镜获取整个心室的高分辨率三维断层图像；结合免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析连接蛋白43(Cx43)分布；以及建立基于单域表示的心肌细胞兴奋和传导的计算模型来验证实验发现。研究使用9只缺乏功能性去糖蛋白-2(desmoglein-2, DSG2)的Dsg2^mut/mut小鼠(DSG2)和9只同窝对照(CTRL)小鼠作为研究对象。

功能表征揭示频率依赖性传导异常

研究人员通过光学映射技术对DSG2和CTRL小鼠心脏进行动作电位(AP)动力学和传导功能表征。结果发现，DSG2心脏在低频(5Hz)和高频(≥10Hz)刺激下表现出明显的电生理差异：AP上升动力学(达峰时间TTP)延长，复极化的AP持续时间(APD₅₀、APD₇₀和APD₉₀)在低频起搏时延长，而在高频起搏时无明显差异。

特别值得注意的是，DSG2心脏在高频起搏时表现出明显的波前不规则性，传导速度减慢，波前变形增加（以角度离散度表示）。这种波前变形在高频刺激时尤为明显，表明纤维化组织区域的传导具有频率依赖性行为特征。

全心室三维重建技术突破

研究完成后，所有心脏均被固定并通过心脏优化的SHIELD协议进行透明化处理，同时保持结构保存。通过组织学分析验证了组织完整性后，研究人员使用基于mesoSPIM的光片显微镜对整个透明心脏心室进行重建。

该显微镜系统采用定制设计的远心透镜和用于光收集的CMOS传感器， resulting in an object field of view(FOV) of approximately1cm²，足以采集整个小鼠心脏的纵向截面，且场曲畸变可忽略不计。通过检测组织荧光和弹性散射信号，成像体素大小为3.25×3.25×3.1μm³，后重采样为各向同性分辨率6×6×6μm³。

研究人员利用组织荧光信号创建了CTRL和DSG2心脏心肌的三维重建，不仅在宏观水平（心室大体解剖）上，而且在微观水平（单个心肌细胞水平可检测到心肌形态）上都实现了重建。散射信号主要源自主要血管和瓣膜周围区域，而在DSG2心脏中，心室壁中也存在升高的散射信号，其拓扑结构从弥漫信号到致密/斑片状区域不等。

心肌和细胞外基质的三维形态计量学

所有心脏断层扫描均基于荧光和散射信号被分割为三个不同的组织类别：心肌（灰色）、非致密纤维化(NCF，绿色，包括间质和弥漫性纤维化）和致密纤维化(CF，黑色，定义为细胞外基质的致密斑块）。

详细的三维形态计量学分析显示DSG2心脏中弥漫性心肌被纤维化组织替代，但没有肥大的证据。左心室腔尺寸（包括腔室体积和平均壁厚）在DSG2和CTRL心脏之间相当。然而，在单个DSG2心脏内，心室壁厚度在中腔部分更易变。DSG2心脏中CF和NCF水平更高，主要位于左心室游离壁，其中也检测到游离壁变薄。

形态功能相关性分析

在独立分析CTRL和DSG2心脏的电生理学和结构特性后，研究人员将二维功能数据共同配准并投影到相应的三维解剖网格上，从而生成1:1的形态功能相关性图。

研究发现，CTRL心脏不包含CF区域，在低频和高频起搏时均显示线性传导模式。相比之下，虽然DSG2心脏中的纤维化区域在低频起搏期间与可检测的传导模式不规则无关，但在高频时在从心肌向纤维化区域过渡的区域观察到传导减慢。

低频起搏期间通过纤维化区域的传导可能由CF的非跨壁性质解释，这可能引起不同跨壁深度的心肌细胞兴奋（不一定在纤维化层水平），结合纤维化斑块内存在传导细胞（心肌细胞和/或非心肌细胞）。为进一步研究跨纤维化组织传导的结构基础，研究人员重建并分析了两个DSG2心脏横截面上的胶原和连接蛋白43(Cx43)，揭示了CF斑块内存在表达Cx43的细胞。

纤维化对传导和心律失常发生的影响

研究发现，在低频支持传导的纤维化结构在高频时可以减慢或阻碍传导，表明波前碎片化可能在室性心动过速或期外收缩等条件下被引发。

通过将这一数据与相应的纤维化重建相对齐，研究人员发现，在窦性心律期间以及当额外刺激在前一个窦性搏动后至少75-80毫秒延迟发生时，通过纤维化区域的传导存在。在较短延迟时，传导在CF附近失败，诱导非持续性室性心动过速，其中激活波前被纤维化组织变形。

这些观察结果与在DSG2心脏中顶端起搏期间观察到的通过纤维化组织的传导的起搏频率依赖性一致。与此一致的是，研究人员发现，在右心室流出道触发的、与窦性搏动间隔短于75毫秒的额外刺激在DSG2中比CTRL心脏更频繁地诱导室性心动过速。

整合计算模型验证机制

研究人员使用计算模型来研究结构特性的功能影响，评估CF斑块、NCF区域或宏观和微观尺度的心肌细胞组织的存在是否可以从定量上解释在DSG2心脏高频时观察到的波前变形。

研究发现，无论解剖准确性如何，基于简单反应-扩散的AP传播模型可以描述CTRL心脏和DSG2心脏在低频起搏时的心肌兴奋和传导。然而，它无法预测DSG2心脏中传导的起搏频率依赖性，在这种情况下，激活时间仅延长约3-4毫秒，而实验在同一心脏中观察到约10毫秒（约60%）的延长。

这种差异表明，仅整合结构特性，即使在高分辨率下，也不足以解释在DSG2心脏高频起搏时揭示的传导异常，而不考虑电生理重塑的其他特征。

纤维化区域电生理重塑的频率依赖性

基于模拟结果，研究人员旨在通过生成APD₉₀、局部传导时间和TTP的差异图，探索从低频向高频起搏频率切换时纤维化区域发生的相关电生理变化。

研究发现，CTRL和DSG2心脏在比较高频与低频时显示APD₉₀均匀缩短，组间空间异质性无显著差异。这些数据否定了DSG2中波前变形是由纤维化和非纤维化组织中心肌细胞AP恢复曲线的明显差异引起的假设，否则可能改变局部不应期并阻止高频传导。

另一方面，研究人员发现DSG2心脏中差异局部传导时间和TTP的空间异质性高于CTRL：局部传导时间主要在AP波首先到达NCF/CF组织区域的区域增加，并且这些变化在空间上与在同一区域发现的TTP增加强烈相关。

局部电生理改变的模拟

研究人员在NCF区域模拟了局部电生理改变，建立了基于单域表示的心肌细胞兴奋和传导的计算模型。

研究发现，在各项异性传导条件下，降低心肌细胞间传导性对高频起搏时的传导影响不显著。仅观察到传导适度减慢，心室激活延迟约4毫秒。类似地，单独减少钠电流（约5毫秒延长）或增加心肌细胞/非心肌细胞耦合（约4毫秒延长）也无法重现实验在高频时观察到的波前变形。另一方面，结合所有这些改变导致传导行为与高起搏频率下的实验发现密切匹配，心室激活时间延长约10毫秒（与实验观察到的延迟相当）。

研究结论与意义

本研究通过创新的相关性成像方法，成功整合了宏观心脏电生理学与整个心室的三维微尺度重建，揭示了致心律失常性心肌病中纤维化组织对电传导的频率依赖性调节机制。

研究发现纤维化区域表现出明显的低频滤波效应：在低心率条件下允许动作电位传导，而在高心率条件下则衰减或阻断传导。这种频率依赖性传导行为是由于纤维化区域中心肌细胞间电耦合受损（Cx43重新分布）、钠电流减少以及心肌细胞与非心肌细胞间电紧张耦合增加共同导致的。这些改变等效于增加了局部电容，轻微静息膜去极化，并降低了AP上升速度，从而导致等效电路的时间常数增加，最终在高频率时导致传导减慢或终止。

该研究的重要意义在于：首先，高刺激频率下观察到的波前变形可能损害心脏收缩性，特别是在需要高效泵功能的条件下，如运动或压力时；更重要的是，这种现象在诱导功能性折返性心律失常基质中起关键作用，如由异位搏动触发的情况。这些发现强调了使用动态起搏协议表征一系列起搏频率下的传导动力学至关重要。

此外，研究强调与心脏纤维化相关的电功能障碍以及某些致心律失常机制无法仅基于心肌和细胞外基质的结构组织可靠预测。即使使用远远超过当前临床成像技术限制的空间分辨率，当纤维化组织被建模为电断开时，这种情况仍然存在。因此，将纤维化区域内和周围的电生理重塑准确整合到预测模型中对于获得可靠预测至关重要。

最后，研究人员提出，进一步努力将心肌细胞/非心肌细胞电紧张耦合纳入模型，将提高预测心律失常易感性和指导重塑心脏组织中可能干预措施的能力。这种方法不仅增强了我们的预测能力，还为个性化治疗策略（包括药理学干预和下一代基因治疗方法的合理设计）提供了信息。

这项研究由Francesco Giardini、Camilla Olianti、Gerard A. Marchal等来自德国弗莱堡大学、意大利国家研究理事会、英国国王学院等多家机构的科学家合作完成，得到了欧盟地平线2020计划、德国研究基金会(DFG)等多个机构的资助支持。