靶向KAT6A/KAT7组蛋白乙酰转移酶复合物：NUP98重排急性髓系白血病的新型治疗策略

本研究发现MYST家族组蛋白乙酰转移酶（HAT）复合物（包括KAT6A/MOZ、KAT7/HBO1及其共同亚基BRPF1）与NUP98融合癌蛋白（FO）在染色质和凝聚体中相互作用。研究表明KAT6A/7抑制可降低全局H3K23ac水平，将NUP98::HOXA9从Meis1位点置换，诱导髓系分化，并在多种NUP98重排白血病异种移植模型中降低白血病负荷。该策略与menin抑制剂协同作用，对menin抑制剂耐药细胞有效，为NUP98重排白血病提供了新的治疗方向。

　　

引言

NUP98融合癌蛋白（FO）是儿童急性髓系白血病（AML）的标志性变异，约占儿科AML的5%，在单核细胞性、巨核细胞性和红系AML中发生率更高。携带NUP98重排（NUP98-r）的儿童患者在接受标准治疗后大多会复发，因此迫切需要更有效的治疗选择，这需要深入了解NUP98 FO驱动白血病的机制。

NUP98是核孔复合体的组成部分，介导大分子在细胞质和细胞核之间的运输。NUP98 FO保留了NUP98的N端Gle2结合序列（GLEBS）结构域和内在无序的苯丙氨酸-甘氨酸（FG）及甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸（GLFG）重复序列。已发现30多种不同的NUP98融合伴侣，许多具有DNA结合同源域或参与组蛋白修饰书写和阅读的结构域（如KDM5A和NSD1）。NUP98 FO通过染色质重塑和造血自我更新驱动白血病发生，部分通过激活造血分化过程中沉默的基因，包括HOX基因簇和MEIS1。

NUP98 FO通过液-液相分离形成核焦点或斑點，作为转录凝聚体发挥作用。NUP98的内在无序区域在所有NUP98 FO中保留，可在体外形成凝胶样凝聚体。通过同型（FO与FO）和异型（FO与DNA或其他蛋白质）相互作用的组合，NUP98 FO核斑點协调细胞转化和白血病基因表达模式。NUP98 FO与参与核输出（如XPO1）和核糖体生物发生（如DDX24）的蛋白质相互作用，以及与转录调节因子相互作用，包括赖氨酸甲基转移酶2A（KMT2A/MLL）-menin和WDR- suppressor of variegation 3-9, enhancer of zeste, and Trithorax（SET）-COMPASS染色质修饰复合物的成员。含有XPO1和KMT2A的FO相关斑點与小鼠胚胎干细胞中Hoxa基因簇和其他关键发育位点的染色质相关联。此外，破坏menin-KMT2A蛋白质-蛋白质相互作用的小分子抑制剂（如VTP-50469、SNDX-5613/revumenib）可将NUP98 FO从染色质上置换，并在携带NUP98-r患者来源异种移植（PDX）的小鼠中延长生存期。然而，对与NUP98 FO相关的染色质复合物、它们如何促进NUP98 FO驱动的白血病以及治疗潜力的全面了解仍然缺乏。

本研究利用小鼠和人类NUP98 FO模型的蛋白质组学和功能基因组学，证明了MYST组蛋白乙酰转移酶（HAT）复合物在NUP98-r白血病中的作用。我们揭示了MYST家族HAT复合物的关键作用，这些复合物乙酰化组蛋白H3 N端尾中的赖氨酸残基，包括KAT6A和KAT7。这些MYST HAT复合物的组分与NUP98 FO相互作用，并在NUP98-r白血病细胞增殖和基因调控中发挥关键作用。最后，我们证明KAT6A/7的小分子抑制剂在NUP98-r白血病的临床前模型中有效，并与menin抑制剂协同作用。

结果

小鼠白血病模型在体外和体内重现NUP98-r疾病

已描述多种NUP98-r模型用于不同的C端易位伴侣，包括NUP98::HOXD13的基因工程小鼠模型，该模型模拟了骨髓增生异常综合征，并有可变进展为急性白血病。然而，缺乏系统比较不同C端融合伴侣作用的研究。在已报告的30多种NUP98融合伴侣基因中，许多在DNA结合或染色质重塑中发挥作用。本研究选择了在儿科白血病和其他血液恶性肿瘤中观察到的八种NUP98 FO，代表了不同的临床特征和融合伴侣多样性。

每种NUP98 FO通过逆转录病毒在小鼠谱系阴性（lin^?）造血干/祖细胞（HSPC）中表达，并在髓系条件下进行集落形成单位（CFU）测定。除NUP98::NSD1外，所有NUP98 FO导致连续重新铺板。此外，我们生成了NUP98::KDM5A和NUP98::NSD1的条件性敲入模型，其中FO表达由内源性Nup98启动子在Cre重组酶存在下驱动。将Nup98::Kdm5a和Nup98::Nsd1小鼠与Vav-Cre动物杂交，以在造血谱系中表达FO。在来自Nup98::Kdm5a;Vav-Cre小鼠、Nup98::Nsd1;Vav-Cre小鼠或Vav-Cre同窝小鼠的lin^? HSPC的CFU测定中，只有NUP98::KDM5A FO表达足以进行细胞转化，这重现了逆转录病毒FO表达的结果。此外，尽管品系之间的细胞类型组成仅观察到 modest 差异，但3个月大的Nup98::Kdm5a;Vav-Cre小鼠与同龄野生型同窝小鼠相比脾脏重量增加，并且将Nup98::Kdm5a;Vav-Cre lin^? HSPC移植到致死照射的同系受体中导致50%（2/4）的小鼠发生髓系白血病，中位潜伏期为232天。几只Nup98::Kdm5a;Vav-Cre小鼠在没有骨髓移植的情况下自发发生髓系白血病。

NUP98 FO与MYST家族HAT复合物相互作用

我们使用快速免疫沉淀（IP）质谱法（RIME）结合无标记定量，研究了多种NUP98 FO模型的蛋白质相互作用组，该方法富集染色质上的相互作用，并允许不同条件之间的定量比较。将HEK293T细胞瞬时转染以表达空载体、血凝素（HA）-NUP98或HA-NUP98 FO，并使用HA抗体进行IP。LC/MS-MS分析揭示了NUP98和NUP98 FO的已知相互作用因子，包括XPO1、RAE1、KMT2A和menin。此外，尽管之前报道过NUP98 FO与HATs CBP和p300的相互作用，但我们观察到与MYST家族HAT复合物成员的相互作用，包括具有酶活性的（KAT6A、KAT7）、阅读器BRPF1和支架MEAF6功能。与空载体数据相比，NUP98::KDM5A RIME数据的基因集富集分析（GSEA）显示组蛋白H3乙酰转移酶复合物成员富集。NUP98::KDM5A和天然NUP98共享大部分相互作用组，但与NUP98相比，BRPF1在NUP98::KDM5A的相互作用因子中显著富集。对另外七种NUP98 FO的类似RIME实验显示，多种NUP98 FO与BRPF1、MEAF6、KAT6A和/或KAT7相互作用的证据，IP- western blot分析证实了HA标记的NUP98::KDM5A、NUP98::HOXA9或NUP98::LNP1与MYST家族HAT复合物蛋白的相互作用。在DNase存在下，相互作用得以维持，并且对于转录共激活因子的子集是特异的，因为使用相同工作流程未能下拉巨核细胞白血病1。使用转染表达HA-NUP98::KDM5A的HEK293T细胞的甘油梯度显示多个级分含有FO和BRPF1，BRPF1是存在于所有三种MYST HAT复合物（KAT6A、KAT6B和KAT7）中的表观遗传阅读器，以及已知的NUP98 FO相互作用因子XPO1，这表明FO和MYST HAT复合物成员存在于相同的复合物中。在CHRF-288-11细胞（一种源自患有携带NUP98::KDM5A的急性巨核细胞白血病患者的人白血病细胞系）中证实了NUP98 FO与MYST HAT复合物的相互作用。由于FO表达水平低且缺乏有效的N端NUP98抗体，我们使用CRISPR/Cas9基因组编辑和同源定向修复在内源性NUP98 FO等位基因上引入HA标签，从而允许通过Western blot检测HA。在该模型中，使用BRPF1抗体进行的IP下拉了HA和KAT7，并且多个甘油梯度级分含有FO、BRPF1和XPO1。此外，在亲本CHRF-288-11细胞系中，对NUP98和KAT6A以及已知的FO相互作用因子KMT2A和menin进行的CUT&RUN揭示了这些染色质复合物在促白血病基因（包括HOXB位点）处的共定位。总之，这些结果表明NUP98 FO可以与MYST家族HAT复合物相互作用，即使在白血病细胞中内源性表达水平也是如此。

基于相分离对NUP98 FO驱动的白血病转化和基因失调的重要性，我们测试了NUP98 FO及其靶基因是否可能与核凝聚体内的其他激活染色质复合物共定位。我们用GFP标记的NUP98::LNP1转染HEK293T细胞，该蛋白形成高度 distinct 的凝聚体，适合定量分析。我们之前的工作表明，HEK293T细胞形成的NUP98 FO凝聚体与在造血细胞中观察到的相似。使用针对MEIS1以及HOXA和HOXB基因簇的mRNA探针在GFP-NUP98::LNP1 HEK293T细胞中进行RNA FISH，显示GFP-NUP98::LNP1和FISH探针针对FO靶基因频繁重叠，共定位发生率明显高于随机预期。在同时存在FO凝聚体和RNA FISH探针的细胞中，FO和RNA在0.75 μm内的重叠在带有MEIS1、HOXB和HOXA探针的细胞中分别观察到14%、18%和9%。这些结果与 prior 研究一致，表明NUP98 FO存在于转录凝聚体内，并表明关键癌基因如MEIS1和HOX簇基因与NUP98 FO凝聚体共定位。

接下来，我们评估了MYST家族HAT复合物成员及其相关的组蛋白翻译后修饰（PTM）是否也可能在凝聚体内与NUP98 FO共定位。表达GFP-NUP98::LNP1的HEK293T细胞使用靶向阳性对照（GFP、XPO1）、MYST家族HATs（KAT6A、KAT7）或相关组蛋白PTM（H3K9ac、H3K14ac、H3K23ac）的一抗和Rhodamine Red-X偶联的二抗进行染色以进行可视化。通过计算红色和绿色信号的Pearson相关系数，在100多个细胞中确定了抗体（红色）信号与FO（GFP）信号在FO凝聚体内的共定位。NUP98::LNP1凝聚体对GFP、XPO1、H3K9ac和H3K23ac抗体显示出高Pearson相关系数值。对于KAT6A、KAT7和H3K14ac信号观察到较低的相关性，但仍然存在发生共定位的凝聚体。总之，我们的结果表明，通过RIME鉴定的MYST HAT复合物成员与NUP98 FO存在于转录凝聚体中，它们可能在白血病基因调控中发挥积极作用。

MYST家族HAT复合物成员是NUP98-r白血病的分子依赖性

为了系统确定NUP98-r白血病发生中的表观遗传依赖性，我们使用靶向337个涉及表观遗传修饰的基因的指导RNA（gRNA）文库进行了CRISPR/Cas9筛选。来自Cas9转基因小鼠的Lin^? HSPC被转导以表达NUP98::KDM5A和gRNA，然后移植到致死照射的同系受体小鼠中。9周后，小鼠出现白血病的临床迹象。在牺牲时，从骨髓和脾脏中分离出髓系（白血病）和T细胞（作为内部对照）。

对肿瘤与非肿瘤细胞中耗竭的gRNA进行测序，提名了NUP98::KDM5A白血病发生所需的阳性调节因子。该体内筛选的顶级命中之一是表观遗传阅读器和MYST HAT复合物成员Brpf1，因为靶向该基因的gRNA在脾脏和骨髓样本中均显著耗竭。此外，靶向参与干细胞分裂和组蛋白乙酰化调节的基因的gRNA是NUP98::KDM5A FO驱动白血病的阳性调节因子，这与HAT复合物在NUP98-r白血病发生中具有核心作用的假设一致。

为了评估MYST家族HAT复合物成员的遗传破坏如何影响NUP98-r细胞适应性，将表达NUP98 FO的Cas9⁺ lin^? HSPC转导以表达靶向感兴趣基因的gRNA（Ametrine⁺），并在培养中与表达对照gRNA（GFP⁺）的细胞竞争。表达靶向Brpf1的gRNA的Nup98::Kdm5a;Vav-Cre;Cas9 lin^? HSPC迅速耗竭。在NUP98::LNP1白血病的Cas9⁺逆转录病毒模型中观察到 comparable 的结果。此外，靶向BRPF1-containing HAT复合物的其他成员（如Meaf6、Kat6a、Kat7或Brd1）的gRNA也导致细胞适应性降低。总之，我们的结果指向（i）KAT6A-和KAT7-containing HAT复合物的特定作用（因为涉及其他HAT复合物的基因（Kat6b、Ing5、Jade1/2/3、Brpf3）不影响NUP98-r细胞的增殖）和（ii）H3乙酰化变化（因为BRPF阅读器 specifically 与H3组蛋白乙酰化相关，而JADE蛋白读取H4修饰）。

药理学HAT复合物抑制导致NUP98-r白血病中乙酰化组蛋白修饰的丧失和髓系分化

KAT6A和KAT7先前与组蛋白H3在赖氨酸9、14和23的乙酰化有关。然而，KAT6A、KAT6B和KAT7对个体组蛋白乙酰化修饰的生化作用仍有待完全确定，并且大多数赖氨酸乙酰转移酶抑制剂对个体MYST家族HATs具有 modest 特异性。尽管最近的数据强调了MYST家族HATs在H3K14和H3K23乙酰化中的贡献，但 few 抗体具有 demonstrated 特异性 for H3K23ac，并且那些 commercially available 的抗体不适合染色质IP（ChIP）或CUT&RUN研究，特别是在小鼠细胞中。

为了克服这些限制并系统评估MYST HAT抑制剂对组蛋白PTMs的影响，我们在用PF9363（一种有效的、口服生物可利用的KAT6A/7 HAT活性小分子抑制剂，目前正在早期临床试验中进行评估）处理的NUP98-r细胞中进行了质谱分析。PF9363在低纳摩尔浓度下抑制KAT6A活性，在较高纳摩尔浓度下抑制KAT7活性。在用1 μmol/L PF9363（靶向KAT6A和KAT7）处理Nup98::Kdm5a;Vav-Cre;Cas9 HSPC 72小时后，显著降低了H3K23ac以及H3K14ac（单独或与H3K9me1、H3K9me2或H3K9me3组合），程度较轻。在10 nmol/L PF9363浓度下（仅靶向KAT6A），观察到H3K23ac减少，但未观察到H3K14ac减少。相比之下，即使在1 μmol/L PF9363处理后，H3K9ac的总体丰度也没有显著改变。总之，这些结果与先前的观察结果一致，即KAT6A破坏导致H3K9ac的位点特异性减少和H3K23ac的全局减少。此外，H3K23ac的更 profound 丧失与先前的工作一致，表明H3K23ac可能是KAT6A的主要靶标，而H3K14ac由KAT7介导，并且仅在较高浓度的PF9363下受到影响。

我们假设PF9363诱导的乙酰化组蛋白修饰丧失会影响关键的促白血病基因并降低白血病细胞适应性，并在NUP98-r细胞中评估了KAT6A/7抑制剂PF9363。用PF9363延长处理（10天）抑制了NUP98::HOXA9、NUP98::KDM5A或NUP98::NSD1模型的生长。实际上，PF9363治疗显示出与menin抑制剂revumenib相当的疗效，后者正在NUP98-r AML的临床试验（NCT04065399）中进行评估。此外，PF9363治疗伴随着CD11b表达的 modest 增加，表明髓系分化。来自Nup98::Kdm5a;Vav-Cre小鼠的HSPC也对PF9363延长处理有反应。

为了评估KAT6A/7抑制在人类NUP98重排模型中的作用，我们用载体（DMSO）或100 nmol/L PF9363处理表达HA-NUP98::KDM5A的脐带血CD34⁺细胞3周。HA-NUP98::KDM5A CD34⁺细胞对PF9363有反应，因为治疗导致细胞生长减少。此外，用100 nmol/L PF9363处理导致CD11b表达增加，类似于我们在NUP98 FO小鼠细胞中的观察结果。

我们还研究了PF9363对正常造血细胞的影响。我们用PF9363处理人类外周血单核细胞（PBMC）72小时，并观察到仅在高浓度（>1 μmol/L）下细胞活力有限降低。在人类脐带血CD34⁺细胞的CFU测定中，PF9363处理导致总集落数减少20%至30%，但所有集落谱系得以维持。用100 nmol/L PF9363处理未转导的CD34⁺ HSPC modestly 减少了细胞生长，并且没有显著改变CD11b的表达。这些数据，连同最近的临床研究数据（其中KAT6A/7抑制剂耐受性良好），表明白血病中KAT6A/7抑制剂存在治疗窗口。

KAT6A/7抑制在体内NUP98-r PDX模型中降低白血病负荷

鉴于NUP98-r白血病细胞对MYST家族HAT活性的强烈依赖性，我们假设KAT6A/7抑制将是NUP98-r PDX模型体内有效的治疗策略。携带患有NUP98::HOXA13和BCR::ABL1的慢性髓系白血病PDX模型（SJCML068699）的小鼠接受载体或75 mg/kg SNDX-5613每天两次或3 mg/kg PF9363每天一次，每周5天，持续6周。用PF9363治疗降低了白血病负荷，并且这种效应在治疗结束后仍持续。值得注意的是，该PDX对SNDX-5613治疗完全耐药，表明KAT6A/7抑制剂在一些NUP98-r白血病中可能与KMT2A-menin抑制剂有非重叠靶点。

我们在另外两个NUP98-r PDX模型中扩展了这些发现，这些模型携带患者中最常见的易位伴侣：NUP98::NSD1（PDX标识符NTPL511和MSKG5191）。携带NTPL511 PDX模型的小鼠（我们先前显示其对menin抑制剂完全有反应）每天接受载体或3 mg/kg PF9363治疗4周。所有载体处理的小鼠发生白血病并在任何PF9363处理的小鼠出现临床疾病之前死亡。然而，五只PF9363处理的小鼠中的两只（40%）最终发生外周血可检测疾病，并且在牺牲时，载体和PF9363处理的动物显示无白血病负荷差异。第二个PDX，MSKG5191，源自一名 heavily pretreated 的儿科AML患者，携带NUP98::NSD1，以及FLT3-ITD、BCORL1、ASXL1、IDH1和WT1突变，并且对menin抑制无反应。每天用3 mg/kg PF9363治疗4周显著降低了血液、骨髓和脾脏中的白血病负荷，尽管正如在NTPL511模型中一样，白血病在PF9363治疗停止后5至8周重新出现。总之，这些结果表明KAT6A/7抑制是NUP98-r白血病的潜在治疗策略，但也表明可能需要联合治疗来完全根除该疾病。

联合KAT6A/7和Menin抑制的疗效

基于这些发现，我们研究了KAT6A/7和menin抑制剂联合治疗是否可能协同作用。用KAT6A/7抑制剂PF9363和/或menin抑制剂SNDX-5613处理Nup98::Kdm5a;Vav-Cre HSPC 10天，显示出协同反应，Bliss协同评分为44.5。1 μmol/L PF9363和1 μmol/L SNDX-5613的组合也抑制了Nup98::Kdm5a;Vav-Cre HSPC在CFU测定中的自我更新。与载体相比，SNDX-5613或PF9363单独处理减少了形成的集落数量，并且SNDX-5613或PF9363处理的集落的免疫表型分析显示CD11b和Gr1表达增加。用KAT6A/7抑制剂WM-1119和menin抑制剂VTP-50469观察到类似的结果。NUP98::NSD1 FO转化的小鼠白血病细胞也对PF9363/SNDX-5613组合有协同反应，Bliss协同评分为24，并且CD11b表达增加 beyond 单药治疗。

基因表达变化和促白血病靶点的染色质重塑驱动对KAT6A/7和Menin抑制剂联合治疗的反应

尽管NUP98 FO凝聚体对白血病表型的重要性，关于药物治疗如何影响FO凝聚体的完整性和特征的数据非常有限。为了研究PF9363和/或SNDX-5613如何影响NUP98 FO凝聚体的特征，我们评估了在表达GFP-NUP98::LNP1的HEK293T细胞中暴露于DMSO、1 μmol/L PF9363、1 μmol/L SNDX-5613或组合24小时后凝聚体的数量和形态。无论处理如何，凝聚体保持完整。所有条件显示相似的斑點体积和体积分数，PF9363处理（单独或与SNDX-5613组合） modestly 降低了斑點密度（每100 μm³的斑點数量）。

我们接下来寻求使用互补方法在分子水平上更好地理解NUP98-r细胞中药理抑制KAT6A/7或遗传失活MYST HAT复合物个体成员的机制。用PF9363处理NUP98::HOXA9小鼠白血病细胞4小时减少了NUP98 FO靶基因Meis1的新生转录，表明KAT6A/7抑制可能直接调节该关键促白血病基因的表达。使用RNA测序（RNA-seq）评估了在用PF9363处理的细胞中基因组范围的基因表达变化，并与用menin抑制剂SNDX-5613或两种药物组合处理的细胞中观察到的变化进行了比较。尽管一些基因在SNDX-5613或PF9363单药治疗后下调，但联合治疗导致基因表达最 robust 的变化，包括NUP98 FO靶基因（包括Meis1和Hoxb基因簇）的表达显著降低。联合治疗还导致干细胞相关基因的下调和单核细胞和GMP基因集的上调。这些结果表明menin-KMT2A和KAT6A/7可能协同调节NUP98 FO靶基因的子集，其中表达通过联合治疗进一步减弱。

由于PF9363在我们RNA-seq研究中使用的药物浓度下对KAT6A和KAT7是非选择性的，我们寻求通过将非靶向对照、Kat6a、Kat6b、Kat7或Brpf1 gRNA引入组成性表达Cas9酶的NUP98::HOXA9小鼠白血病细胞中来确定每个复合物如何调节促白血病基因表达。Brpf1的丧失对基因表达具有最 profound 的影响，Kat6a、Kat6b或Kat7的个体遗传敲除重现了PF9363处理诱导的许多基因表达变化。此外，将药物诱导的基因调控变化与Kat6a/7组分的遗传丧失进行比较的GSEA在每个CRISPR/Cas9模型中显示出 statistically significant 的相关性。总之，这些数据表明Kat6a、Kat6b和Kat7调节独特但部分共享的靶基因集，这些靶基因可能对PF9363的治疗效果至关重要。

我们接下来寻求定义可能有助于对PF9363单独和与SNDX-5613组合反应的染色质变化。ChIP测序（ChIP-seq）显示NUP98 FO、Kmt2a和Brpf1在Meis1和其他关键促白血病基因的转录起始位点（TSS）附近共定位并 spread into the gene body。用SNDX-5613和/或PF9363处理导致NUP98 FO从转录敏感基因（如Meis1等）的染色质上置换。ChIP-seq和ChIP-qPCR均显示，在Meis1 TSS和基因体处，Kmt2a和Brpf1的染色质占据受到PF9363处理的影响，在PF9363和SNDX-5613组合处理的细胞中影响更大。此外，RNA聚合酶II的ChIP-qPCR显示，在SNDX-5613或PF9363单药治疗后，Meis1 TSS和基因体内的染色质占据显著减少，联合治疗后减少更大。值得注意的是，我们在没有 altered 基因表达的基因（如Hoxa9）处未观察到类似的变化，并且PF9363和/或SNDX-5613处理未导致全局染色质重塑。

结合我们在Nup98::Kdm5a;Vav-Cre HSPC中观察到的H3K