AAnet神经网络解析乳腺癌表型连续体中原型细胞状态的空间组织与代谢异质性

本刊推荐：本研究开发了原型分析网络（AAnet），通过神经网络学习单细胞数据表型连续体中的原型状态（AT）。该技术克服了传统聚类和轨迹推断的局限性，在三阴性乳腺癌（TNBC）模型中成功识别出五种原型状态（增殖性、氧化/脂肪生成性、缺氧性、细胞损伤/死亡性和免疫刺激性），并证实这些状态在匹配的肝、肺和淋巴结转移中重现。空间转录组学揭示了肿瘤内原型组织的空间结构及癌症与基质细胞间的镜像关系。研究发现缺氧AT中的GLUT3对肿瘤生长和转移至关重要，为靶向治疗提供了新方向。

　　

研究背景与技术瓶颈

癌症细胞通过动态改变功能状态以适应生存环境，形成肿瘤内表型连续性的细胞状态分布。传统单细胞转录组数据分析方法主要依赖聚类分析和轨迹推断，但当数据缺乏明显的簇状结构或谱系结构时，这两种方法均无法有效表征细胞状态空间。原型分析（Archetypal Analysis, AA）作为一种因子分析技术，能够识别数据集中的"原型"（Archetypes, AT）即极端状态，并将所有数据点表示为原型的凸组合。然而传统AA方法假设数据呈单纯形结构，且无法处理单细胞数据的高度非线性和噪声特性。

AAnet算法的创新性突破

研究团队开发的原型分析网络（AAnet）采用自动编码器框架，通过学习将数据转换为单纯形潜在空间来实现非线性AA。该网络包含三个核心创新：

1）通过编码器-解码器架构学习数据到单纯形空间的变换

2）引入原型损失函数确保数据点在潜在空间中的单纯形结构

3）开发扩散极值点识别算法，基于数据几何结构识别极端点作为原型初始化

AAnet在模拟数据集上的测试显示，其在不同非线性程度下都能准确识别真实原型，性能显著优于传统AA方法（如PCHA、kPCHA等）。在抗原特异性CD8⁺ T细胞数据集上的验证进一步证实了AAnet在真实生物学数据中的适用性，成功识别出 na?ve、干细胞样和耗竭T细胞状态。

三阴性乳腺癌原型状态的系统解析

应用AAnet分析MDA-MB-231三阴性乳腺癌（TNBC）小鼠模型的单细胞转录组数据，在原发性肿瘤中鉴定出五种稳定的原型状态：

¹ 增殖性AT（蓝色）：富集细胞周期相关基因（CDC20、CDK1、CDK4）、G2/M检查点和E2F靶点特征，>95%细胞处于S或G2/M期

² 氧化/脂肪生成性AT（黄色）：显示氧化磷酸化（OXPHOS）、活性氧（ROS）和脂肪生成特征，富含电子传递链组分和过氧化氧还蛋白家族（PRDX1/2/4/6）

³ 缺氧性AT（橙色）：富集缺氧和糖酵解特征，表达GLUT1（SLC2A1）、GLUT3（SLC2A3）和糖酵解酶（ENO2、HK2、LDHA、GAPDH）

⁴ 细胞损伤/死亡AT（琥珀色）：显示线粒体编码的电子传递链组分高表达，与技术因素和细胞损伤相关

⁵ 免疫刺激性AT（紫色）：表达免疫调节基因（CXCL1、IFITM2/3、BST2、HLA-A/B/C、B2M、ICAM1），96%细胞处于G1期

这些原型状态在四个独立原发性肿瘤样本中高度保守（平均余弦相似度0.77-0.97），且在不同转移部位（淋巴结、肝脏、肺部）中表现出组织特异性分布模式。

空间转录组学揭示原型组织的空间架构

通过空间转录组学（Visium）分析，研究团队发现AAnet识别的原型状态在肿瘤组织中呈现明确的空间分布：

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  增殖性AT形成肿瘤主体，但避开中央区域
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  缺氧性AT定位于中央和外围区域，与增殖性AT互斥
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  氧化性AT与增殖性AT毗邻分布
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  免疫刺激性AT环绕缺氧区域分布

利用单细胞多模态生成对抗网络（scMMGAN）将空间数据映射到单细胞空间，证实了原型亲和性与标记基因表达评分间存在高度互信息。

肿瘤微环境与原型的互作网络

分析肿瘤微环境（小鼠来源数据）识别出六种微环境原型状态：

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  导管性ME-AT（表达乳腺上皮细胞标记）
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  脂肪细胞ME-AT（定位于肿瘤边缘残留乳腺脂肪垫）
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  基质性ME-AT（富集成纤维细胞、周皮细胞和ECM组织特征）
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  中性粒细胞ME-AT（富集糖酵解和白细胞趋化特征）
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  髓系ME-AT（富集单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞标记）
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  抗原应答ME-AT（富集抗原呈递和免疫球蛋白应答特征）

空间关联分析揭示了癌症原型与微环境原型间的特异性互作：

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  增殖性AT与髓系和基质ME-AT共定位
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  缺氧性AT特异性与中性粒细胞ME-AT共定位
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  免疫刺激性AT与抗原和中性粒细胞ME-AT关联

配体-受体分析发现各原型状态特有的细胞间信号网络，如缺氧性AT中CD44-MIF互作促进中性粒细胞聚集，免疫刺激性AT中MMP9-Itgam、IL1A-Il1rap和Hmgb1-TLR2等信号对介导免疫-癌症细胞交叉对话。

代谢异质性及其治疗意义

研究重点关注了代谢异质性，发现：

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  增殖性和氧化性AT富集三羧酸循环（TCA cycle）酶表达
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  缺氧性AT特异性富集糖酵解酶（PDK1等）
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  这种代谢分化在癌症细胞和关联微环境细胞中呈现镜像关系

功能实验证实缺氧性AT关键代谢基因GLUT3（SLC2A3）的重要性：

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  siRNA敲低GLUT3显著降低葡萄糖摄取和基础糖酵解
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  抑制肿瘤球形成能力（normoxia和hypoxia条件下）
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  显著减少体内转移性生长

免疫荧光分析显示GLUT3⁺细胞与HIF1α⁺细胞的平均距离显著小于与CD31⁺内皮细胞的距禿，证实GLUT3表达在缺氧区域富集。条件DREMI分析显示HIF1α与GLUT3表达间存在正依赖性，且GLUT3对HIF1α的依赖性更强。

人类乳腺癌样本的保守性分析

在34个人类乳腺癌样本（15个ER⁺、13个TNBC、6个HER2⁺）中应用AAnet，识别出155个原型状态。虽然人类样本与小鼠模型间存在差异，但仍观察到保守模式：

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  18个人类AT与缺氧性AT相似，显示糖酵解特征和低TCA循环表达
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  8个人类AT与增殖性AT相似，显示低缺氧基因表达和高TCA循环基因
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  多个患者样本AT显示免疫相关标记（IFITM2/3、BST2、HLA-A/B/C、B2M）富集

这些发现表明AAnet能够识别跨乳腺癌亚型的表型相似性，提供了超越激素和分子分型的肿瘤功能分类方法。

研究意义与未来展望

AAnet为解决肿瘤异质性这一重要临床挑战提供了强大工具，能够将肿瘤划分为功能 distinct 的区域，这些区域包含与独特细胞微环境相关的癌症细胞状态。通过分类患者 according to biological ATs，可能改进肿瘤亚分类策略。应用于特定治疗前后的样本，可以了解原型状态随时间、治疗反应和不同转移部位的动态变化，最终为开发改进的有效治疗策略提供知识基础。