AAnet神经网络解码三阴性乳腺癌表型连续体中的关键细胞状态与空间异质性

本刊推荐：本研究利用新型神经网络AAnet（Archetypal Analysis network）首次系统解析了三阴性乳腺癌（TNBC）在表型连续体中的关键细胞状态。该研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学技术，鉴定出5个具有明确生物学功能的原型状态（AT），包括增殖型、氧化/脂肪生成型、缺氧型、细胞损伤/死亡型和免疫刺激型。研究发现这些原型状态在原发性肿瘤和转移灶中高度保守，并具有明确的空间组织模式。特别重要的是，研究团队发现缺氧型AT中葡萄糖转运蛋白GLUT3（SLC2A3）的表达对肿瘤生长和转移至关重要，为TNBC治疗提供了新的潜在靶点。

　　

研究背景与意义

肿瘤细胞能够动态改变其功能状态以适应生存环境，这在三阴性乳腺癌（TNBC）中表现得尤为明显。TNBC由于缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）表达，是目前最具异质性的乳腺癌亚型，缺乏有效的靶向治疗方案。识别肿瘤表型连续体中的关键细胞状态及其空间组织结构，成为当前癌症生物学和计算生物学面临的重要挑战。

方法学创新：AAnet神经网络

研究团队开发了原型分析网络（AAnet），这是一种专门设计用于在单细胞数据中识别原型状态的神经网络。与传统聚类或轨迹推断方法不同，AAnet能够学习数据到单纯形潜在空间的非线性变换，通过自编码器框架识别极端细胞状态。

AAnet的核心创新包括：

1. 1.
   通过扩散极值点识别算法确定原型数量
2. 2.
   使用单纯形形状的潜在空间进行原型分析
3. 3.
   结合重构损失、原型损失和极值点损失进行联合优化

与现有方法相比，AAnet在模拟数据和真实生物数据（如抗原特异性CD8⁺ T细胞数据）中都表现出更优越的性能，能够准确识别非线性数据结构中的关键细胞状态。

TNBC原型状态的发现

研究团队利用高度转移性MDA-MB-231乳腺癌细胞构建了TNBC小鼠模型，通过scRNA-seq分析了28,478个原发性肿瘤细胞，发现了5个稳定的原型状态：

增殖型AT（蓝色）

该状态富含细胞周期相关基因，包括CDC20、CDK1和CDK4等调控细胞周期进程的关键因子。超过95%的细胞处于S期或G2/M期，表现出强烈的增殖活性。该状态还富集MYC靶标和mTORC1信号通路，与TNBC的临床特征高度一致。

氧化/脂肪生成型AT（黄色）

该状态以氧化磷酸化（OXPHOS）为最显著特征，电子传递链组分显著上调。同时表现出活性氧（ROS）通路和脂肪生成相关基因的富集，包括过氧化物酶家族基因PRDX1/2/4/6。这种代谢状态与化疗耐药和不良预后密切相关。

缺氧型AT（橙色）

该状态显著富集缺氧标志物和糖酵解酶类，包括葡萄糖转运蛋白SLC2A1（GLUT1）和SLC2A3（GLUT3），以及ENO2、HK2、LDHA和GAPDH等关键糖酵解酶。核糖体亚基也在此状态中显著表达，表明缺氧与核糖体生物发生之间存在密切联系。

细胞损伤/死亡型AT（琥珀色）

该状态以线粒体编码的电子传递链组分高表达为特征，但体细胞编码的ETC组分表达有限，表明这些细胞可能处于损伤或死亡状态，部分可能来源于技术因素引入的变异。

免疫刺激型AT（紫色）

该状态独特地表达高水平免疫刺激分子，包括CXCL1、IFITM2/3、BST2、HLA-A/B/C和B2M等。96%的细胞处于G1期，可能代表了一种G1阻滞的免疫刺激状态。

转移灶中的原型状态保守性

研究进一步分析了匹配的淋巴结（LN）、肝脏和肺转移灶中的42,250个细胞，发现原型状态在不同转移部位高度保守。淋巴结转移与原发性肿瘤最为相似，所有5种AT都被保留；肝脏转移缺少氧化型AT；而肺转移则出现了一个新的代谢相关AT，同时缺氧型AT消失，反映了不同微环境对细胞状态的选择压力。

空间转录组学揭示原型组织模式

通过空间转录组学分析，研究团队发现这些原型状态在肿瘤组织中具有明确的空间分布模式：

增殖型AT形成肿瘤的主体结构，但远离中央区域

氧化型AT与增殖型AT相邻分布

缺氧型AT定位于肿瘤中央和外围区域，与血管分布区域远离

免疫刺激型AT环绕缺氧区域分布，形成明显的边界

肿瘤微环境与原型的相互作用

研究团队进一步分析了肿瘤微环境（ME）的组织结构，发现了6种微环境原型状态，包括导管型、脂肪细胞型、基质型、中性粒细胞型、髓系细胞型和抗原应答型。这些微环境状态与特定的肿瘤细胞原型存在明显的共定位关系：

增殖型和氧化型AT与髓系和基质ME-AT共定位

缺氧型AT特异性与中性粒细胞ME-AT共定位

细胞死亡型AT与抗原ME-AT强烈关联

配体-受体对分析揭示了肿瘤细胞与微环境之间复杂的信号交流网络，包括血小板衍生生长因子（PDGFC-Pdgfrb）、纤维母细胞生长因子（FGF12-Fgfr1）和CD44-Mif等关键信号通路。

GLUT3在缺氧型AT中的关键作用

研究团队发现GLUT3在缺氧型AT中特异性高表达，体外实验表明敲低SLC2A3可显著降低葡萄糖摄取、基础糖酵解和细胞增殖。在体内实验中，GLUT3敲低显著抑制了肿瘤球形成能力和转移定植能力。

免疫荧光分析显示，GLUT3阳性细胞与HIF1α阳性细胞的距离显著小于与CD31阳性细胞的距离，表明GLUT3阳性细胞富集于远离血管的缺氧区域。条件DREMI分析进一步证实了HIF1α与GLUT3表达之间的正相关关系。

人类TNBC样本中的验证

在34个人类乳腺癌样本（15个ER⁺、13个TNBC和6个HER2⁺）的分析中，AAnet成功识别了与小鼠模型中相似的代谢原型状态。18个人类AT与缺氧型AT相似，8个与增殖型AT相似，这些代谢原型在不同分子亚型的乳腺癌中广泛存在。

讨论与展望

本研究通过AAnet这一创新工具，首次系统解析了TNBC的表型连续体，揭示了关键细胞状态的空间组织和功能特性。研究发现不仅深化了对肿瘤异质性的理解，还为TNBC的治疗提供了新的靶点策略。

特别重要的是，GLUT3作为缺氧型AT的关键调控因子，其表达主要局限于大脑和精子等正常组织，而在TNBC中高表达并与转移和不良预后相关，使其成为极具潜力的治疗靶点。未来研究可进一步探索针对不同原型状态的联合治疗策略，为TNBC患者提供更精准的治疗方案。

AAnet作为一种通用工具，还可广泛应用于免疫学、发育生物学等领域的单细胞数据分析，为解析细胞状态连续体提供强有力的技术支持。通过将患者按照生物学原型状态进行分类，有望超越传统的分子分型，实现更精准的肿瘤分类和治疗策略制定。