AAnet神经网络解析三阴性乳腺癌单细胞表型连续体中的代谢异质性及空间组织

本文推荐AAnet（Archetypal Analysis network）这一新型神经网络工具，它通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学数据，解析三阴性乳腺癌（TNBC）中癌细胞沿表型连续体的异质性状态。该研究识别了五种代谢相关原型状态（AT），发现缺氧原型中GLUT3（SLC2A3）对肿瘤生长和转移的关键作用，并揭示了原型状态与肿瘤微环境（ME）的空间共定位关系，为靶向代谢异质性提供了新视角。

　　

背景与挑战

癌症细胞能够动态改变其功能状态以适应生存需求，这在肿瘤内形成了一个动态的表型连续体。目前，表征单细胞转录组数据细胞状态异质性的两种主要方法是聚类分析和轨迹推断。然而，当细胞状态之间没有清晰的界限，或者数据流形上没有清晰的轨迹或谱系结构时，这两种方法都难以有效映射细胞状态空间。因此，需要一种能够在单细胞分辨率下解析细胞异质性，同时保留细胞状态连续体上连续变异的方法。为此，研究者转向原型分析（Archetypal Analysis, AA），这是一种因子分析技术，首先提取代表数据集“原型”（Archetype, AT）或极端状态的因子，然后所有数据点都可以描述为这些原型的凸组合。

方法创新：AAnet神经网络

研究者开发了AAnet，一种用于非线性原型分析的神经网络。与传统线性AA方法（如PCHA）在环境空间中拟合单纯形不同，AAnet利用自编码器（autoencoder）框架学习数据到单纯形形状的潜在空间的变换。AAnet的编码器学习从数据空间到由单纯形约束的潜在空间的最佳变换，解码器则学习从潜在空间回到数据空间的变换。这意味着AAnet通过非线性降维学习原型以及每个数据点作为原型凸组合的表征。这为原型状态检测增加了灵活性和准确性，同时保留了数据几何结构。

AAnet的架构包括一个编码器-解码器结构，并通过原型损失（archetypal loss）和扩散极值损失（diffusion extrema loss）进行正则化。扩散极值根据数据几何结构推断极值点，用于初始化原型并确定原型数量k。一旦模型训练完成，单纯形潜在表征可用于探索数据集。潜在空间中的顶点（由标准基“one-hot”向量编码）可以被解码回基因空间中的原型，从而能够表征和比较它们的表达谱。

在TNBC模型中的验证与应用

研究者将AAnet应用于研究三阴性乳腺癌（TNBC）。他们利用高度转移性MDA-MB-231乳腺癌细胞构建了体内TNBC模型，并收集了原发肿瘤以及匹配的淋巴结（LN）、肝脏和肺转移灶的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据。此外，还对原发肿瘤进行了空间转录组学分析。

应用AAnet对原发肿瘤细胞异质性进行分析，在每个数据集中均识别出五个原型状态（AT），代表了不同的生物学功能：

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  增殖原型（蓝色）：富集细胞增殖相关标志（G2/M检查点、E2F靶点等），高表达CDC20、CDK1、CDK4等细胞周期调控基因。
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  氧化/脂肪生成原型（黄色）：与氧化代谢和应激相关，最显著富集氧化磷酸化（OXPHOS）通路，并涉及活性氧（ROS）产生和脂肪生成。
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  缺氧原型（橙色）：显著富集缺氧标志，并富集糖酵解酶（如SLC2A1/GLUT1、SLC2A3/GLUT3、ENO2、HK2、LDHA），表明该原型细胞处于低氧环境并使用糖酵解代谢。
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  细胞损伤/死亡原型（琥珀色）：标记基因多为线粒体基因组编码的电子传递链（ETC）组分，与受损和垂死细胞相关。
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  免疫刺激原型（紫色）：癌细胞高表达免疫刺激相关mRNA，如CXCL1、IFITM2/3、BST2、HLA-A/B/C等，富集免疫信号和凋亡相关通路。

这些原型在原发肿瘤之间高度保守。分析细胞对每个原型的亲和力（archetypal affinity）发现，原发肿瘤中 committed（亲和力>0.5）的细胞比例超过60%，但不同原型的细胞丰度存在差异。

转移灶中的原型异质性

对匹配的淋巴结、肝脏和肺转移灶的分析表明，转移灶中的细胞异质性同样遵循表型连续体。AAnet在转移灶中也稳健地识别出原型，且原发肿瘤中鉴定出的原型在至少两个转移部位存在正交同源原型，并显示出高度保守的 hallmark 基因集富集模式。然而，不同组织中原型对细胞异质性的相对贡献有所不同：淋巴结转移与原发肿瘤最为相似；肝脏转移缺少氧化原型，增殖和免疫刺激原型细胞比例显著增加；肺转移则表现出最大差异，增殖原型细胞比例较低，氧化原型丰度较高，且未检测到缺氧原型，并出现了一个与氧化代谢和免疫信号相关的独特第五原型。

空间转录组学揭示原型空间组织

通过空间转录组学数据并结合scMMGAN进行模态对齐，研究者将AAnet从scRNA-seq数据中学习到的原型映射到原发肿瘤的组织切片空间位置。结果显示，不同的癌细胞原型在肿瘤内具有独特且清晰的空间组织：

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  增殖原型：形成肿瘤的主体，但明显缺失于每个肿瘤切片的中央区域。
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  氧化/脂肪生成原型：与增殖原型位置邻近。
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  缺氧原型：定位于原发肿瘤的中央和外围区域，与增殖和氧化原型分离。
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  细胞损伤/死亡原型：与增殖和氧化原型相关，可能识别肿瘤内富氧区域。
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  免疫刺激原型：亲和力最高的区域围绕肿瘤内的缺氧原型，这些区域富集细胞因子和抗原呈递蛋白表达。

这表明AAnet定义的原型在肿瘤内具有独特的空间组织结构。

肿瘤微环境与原型的关联

进一步分析肿瘤微环境（ME）的小鼠基因表达数据，AAnet将微环境解卷积为六个微环境原型（ME-AT），包括导管、脂肪细胞、基质、中性粒细胞、髓系和抗原应答ME-AT。分析揭示了癌细胞原型与特定微环境原型之间的空间关联。例如，增殖原型区域与髓系和基质ME-AT强烈相关；缺氧原型与中性粒细胞ME-AT特异性共定位；细胞死亡原型与抗原ME-AT相关；免疫刺激癌细胞原型与抗原和中性粒细胞ME-AT相关。配体-受体对分析进一步揭示了癌细胞与微环境之间潜在的旁分泌相互作用机制。

在免疫正常的MMTV-PyMT小鼠TNBC模型中验证，AAnet同样识别出与MDA-MB-231模型中原型相对应的原型状态，并且细胞间通讯分析显示，免疫刺激原型（尽管丰度最低）与微环境（如髓系细胞、成纤维细胞）的相互作用最为丰富，提示其在维持空间组织和调节炎症微环境中的功能作用。

代谢异质性与GLUT3功能验证

值得注意的是，富含OXPHOS的增殖原型和富含糖酵解的缺氧原型在肿瘤内空间定位不同。研究者重点关注了缺氧原型中高表达的葡萄糖转运蛋白GLUT3（SLC2A3）。在三种TNBC细胞系（MDA-MB-231, HCC1806, HCC38-CD44^Hi）中敲低SLC2A3，证实其能显著降低葡萄糖摄取、基础糖酵解、细胞增殖、肿瘤球形成能力以及体内肿瘤发生和转移能力。免疫荧光染色显示，在MDA-MB-231异种移植物和TNBC患者来源异种移植物（PDX）模型中，GLUT3阳性细胞与HIF1A阳性细胞的距离显著小于与CD31阳性内皮细胞的距离，表明GLUT3阳性细胞富集在远离血管的缺氧区域。条件DREMI评分分析显示GLUT3与HIF1A表达之间存在正依赖性，且GLUT3对HIF1A的依赖性更强，提示HIF1A表达可能先于并调控GLUT3。

在人类乳腺癌样本中的普适性

对来自34个人类乳腺癌样本（包括ER⁺、HER2⁺和TNBC亚型）的单细胞数据应用AAnet，结果揭示了人类肿瘤中存在的原型异质性。研究者鉴定出18个与缺氧原型相似的人类癌症原型和8个与增殖原型相似的原型。这些代谢原型在乳腺癌中普遍存在，并且在乳腺癌亚型之间没有显著富集，表明AAnet可以用于识别跨癌症亚型的表型相似性，提供了一种超越激素和分子分型的、基于功能的方法来对乳腺癌进行分型。

讨论与展望

AAnet能够将肿瘤分解为功能不同的区域，这些区域包含与独特细胞微环境相关的癌细胞状态。这使得解析肿瘤异质性达到前所未有的水平。未来，使用AAnet等工具根据生物学原型对患者进行分类，可能会改进肿瘤的亚分类。通过对特定治疗前后样本的分析，可以了解原型如何随时间变化、对不同疗法的反应以及在不同转移部位的情况。最终，这些工具可能为开发改进的有效治疗策略提供所需的知识。AAnet因其在癌症、免疫学和发育等多种背景下广泛表征细胞异质性的能力而具有广泛应用的潜力。