基于线粒体全基因组的藤壶系统发育分析方法比较：基因排列、蛋白编码基因与COX1标记区域的性能评估

《Scientific Reports》：Relative performance of three phylogenetic methods based on complete mitochondrial genomes of barnacle

本研究针对海洋无脊椎动物复杂进化历史导致的系统发育关系解析难题，比较了基于34个藤壶线粒体全基因组的三种系统发育构建方法。研究人员通过基因排列分析发现两个基因组重排热点区域（区域I和II），证实串联蛋白编码基因（PCGs）方法在单系群保持率（78.8%）上显著优于COX1标记区域（61.3%）和基因排列（50.0%）。结果表明PCGs最适合藤壶系统发育研究，COX1适用于快速物种鉴定，而基因排列可揭示基因组进化模式，为海洋无脊椎动物线粒体系统发育方法选择提供了重要依据。

　　

在浩瀚的海洋中，藤壶这类看似不起眼的甲壳动物却拥有着极其复杂的进化历史。由于海洋无脊椎动物长期适应多变环境，其线粒体基因组呈现出丰富的多样性，这为解析它们的系统发育关系带来了巨大挑战。传统上，研究人员主要依赖三种不同的线粒体数据构建进化树：基因排列顺序、串联蛋白编码基因（PCGs）序列以及通用的细胞色素c氧化酶亚基I（COX1）标记区域。然而，这些方法各有优劣，且鲜有研究系统比较它们在海洋无脊椎动物中的适用性。

为了解决这一难题，韩国海洋生物多样性研究所生态与保护系的Seongjun Bae团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果。研究人员选取了藤壶这一理想模型——它们不仅具有丰富的线粒体基因排列模式，而且已有相当数量的完整线粒体基因组数据可供分析。研究团队新测序了三种藤壶（Amphibalanus eburneus、Fistulobalanus kondakovi和Megabalanus rosa）的完整线粒体基因组，并结合31个已发表的基因组数据，构建了包含34个物种的数据集。

研究采用三种系统发育分析方法：基于最大似然法的基因排列分析（MLGO）、基于13个PCGs串联序列的分析以及基于658bp COX1标记区域的分析。为了客观评估这些方法的性能，研究人员采用了Robinson-Foulds（RF）距离和单系群保持率两个量化指标。

关键技术方法包括：使用NovaSeq 6000系统进行高通量测序，通过MitoZ v3.5进行线粒体基因组组装，采用MLGO和RAxML分别构建基因排列和序列进化树，利用R语言中的phangorn和ape包进行RF距离计算和单系群评估。所有分析均基于从韩国海岸采集的藤壶样本（表S1）。

基因排列分析揭示基因组重排热点

通过基因排列构建的系统发育树显示出与传统分类系统显著不同的拓扑结构。出人意料的是，外群物种（Pollicipedomorpha）并未与内群物种（Balanomorpha）形成明显分离的支系，而是混杂在多个支系中。研究共识别出10个不同的进化支（C1-C10），其中Balanidae科的25个物种被分散在四个不同的支系中。

特别值得注意的是，研究人员发现了三个基因组重排活跃区域。区域I和II表现出异常高的断点密度（分别为319和100），显著高于全基因组平均水平（87），被确认为重排热点（p<0.001）。区域III虽然断点活动最少（仅2个断点），但在C6-C10五个进化支中广泛分布，表明其具有不同的进化意义。这些热点区域可能源于串联重复事件后的随机基因丢失，或是tRNA密度较高区域的结构不稳定性促进的重组介导重排。

蛋白编码基因分析展现最佳系统发育分辨率

基于13个PCGs串联序列构建的系统发育树表现出最佳性能。与外群形成明显分离的单系群（支持率>95%），与传统分类系统一致。大多数科级分类单元（除Balanidae外）都形成了明确的单系群，支持现有的分类系统。

Balanidae科未能形成单系群，其中Chthamalus属物种（Chthamalidae科）嵌套在Balanidae内，这一现象在所有三种方法中一致出现，提示可能需要对该科进行重新分类。新测序的三种物种在其各自属内形成了明确的进化支，进一步验证了该方法的可靠性。

COX1标记区域适用于物种鉴定而非深层系统发育

基于COX1标记区域的系统发育树分辨率较低，内外群未能清晰分离，多个科级分类单元未能形成单系群。例如，Balanidae物种分散在两个不同的支系中，Chthamalidae物种也呈现碎片化分布。虽然Megabalanus属形成了相对一致的群组（支持率72-100%），但整体而言，该方法在解析深层系统发育关系方面表现不佳。

三种方法的比较评估揭示各自适用场景

量化比较显示，三种方法在RF距离和单系群保持率上存在显著差异。基因排列树与其他方法的差异最大（与13个PCGs树和COX1树的RF距离分别为0.82和0.92），而13个PCGs树与COX1树的拓扑结构相对接近（RF距离0.55）。

在单系群保持率方面，13个PCGs方法表现最佳（78.8%），显著高于COX1标记区域（61.3%）和基因排列（50.0%）。这一结果突显了PCGs方法在恢复已建立分类关系方面的优势。

研究结论与重要意义

本研究系统比较了三种线粒体系统发育方法在藤壶进化研究中的性能，得出以下重要结论：串联13个PCGs的方法在单系群保持和拓扑分辨率方面表现最优，最适合进行全面的系统发育研究；COX1标记区域由于序列较短、进化速率快，更适合用于快速物种鉴定而非深层系统发育分析；基因排列分析虽然在全系统发育重建中性能有限，但能有效揭示基因组进化模式，特别是通过识别重排热点区域。

值得注意的是，所有三种方法一致显示Balanidae科不是单系群，这为重新评估该科的传统分类提供了有力证据。同时，Tetraclitidae科在所有方法中都保持为单系群，支持其现有的形态学分类。

这项研究不仅为藤壶系统发育研究提供了方法学指导，其结论也适用于其他海洋无脊椎动物类群。研究人员强调，未来研究应结合核基因组数据和形态学特征，以解决线粒体数据揭示的分类不一致问题。该研究深化了我们对线粒体基因组在进化研究中价值的理解，并强调了选择适当方法解决复杂系统发育问题的重要性。