凝血酶通过促进血管新生与巨噬细胞M1型极化驱动小鼠椎间盘退变的机制研究

本研究揭示了凝血酶（thrombin）在椎间盘退变中的关键作用：通过蛋白酶激活受体1（PAR1）介导的信号通路，诱导单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）表达，促进巨噬细胞迁移并向促炎M1表型（CD86+/iNOS+）极化，同时增强血管内皮生长因子（VEGF）表达与血管新生（angiogenesis），最终导致椎间盘基质降解。使用PAR1拮抗剂SCH79797可有效阻断该过程，为治疗椎间盘退行性疾病提供了新靶点。

　　

引言

全球范围内腰背痛患者人数已从2020年的6.19亿增长至2050年预估的8.43亿，成为导致运动功能障碍和经济负担的重要健康问题。椎间盘退变是腰背痛的主要病因之一，其病理过程涉及炎症反应、细胞衰老和血管侵入等现象。生理状态下椎间盘无血管分布，而退变椎间盘的外层纤维环可出现血管侵入现象，但具体炎症机制尚未明确。既往研究表明，凝血酶作为凝血系统的核心酶类，不仅参与血液凝固，更与炎症免疫反应密切相关。

体外与体内实验证实椎间盘退变诱导凝血酶和MCP-1产生

通过小鼠尾椎椎间盘器官培养系统发现，100 nM凝血酶刺激72小时后，Safranin-O染色显示软骨基质中蛋白聚糖显著丢失，表明椎间盘发生降解。同时，定量PCR和ELISA检测证实凝血酶刺激组MCP-1表达显著升高（p=0.043；p<0.001）。在体内尾椎穿刺模型中，穿刺后椎间盘同样出现Safranin-O染色减弱和形态学退变。免疫组化分析显示，穿刺组椎间盘尤其在髓核（NP）和软骨终板（CEP）区域出现凝血酶和MCP-1表达上调趋势。

凝血酶诱导巨噬细胞向M1表型极化

对小鼠骨髓巨噬细胞的研究表明，凝血酶刺激后M1型标志物CD86和iNOS表达显著上升，而M2型标志物CD163和精氨酸酶1（arginase-1）表达下降。Western blotting结果进一步验证了这一极化趋势，提示凝血酶具有驱动巨噬细胞向促炎M1表型分化的作用。

体内穿刺模型证实M1型巨噬细胞浸润

穿刺处理后3周，椎间盘组织免疫染色显示巨噬细胞标志物Iba1表达升高。M1标志物iNOS在穿刺组显著表达，而M2标志物精氨酸酶染色微弱。Western blotting定量分析显示CD86表达显著上调（p=0.0040），CD163表达下降（p=0.0013），表明体内退变椎间盘中以M1型巨噬细胞浸润为主。

PAR1拮抗剂SCH79797抑制凝血酶诱导的椎间盘退变

通过尾椎穿刺模型评估PAR1拮抗剂SCH79797的治疗效果，发现该拮抗剂显著延缓了Safranin-O染色减弱和椎间盘退变评分恶化（p=0.02）。组织学评分系统证实，SCH79797治疗组在穿刺3周后椎间盘退变程度显著低于对照组。

PAR1拮抗剂抑制凝血酶生成与M1极化

免疫组化显示，穿刺组椎间盘凝血酶表达升高，而PAR1拮抗剂处理组则显著抑制该现象。同时，CD86和iNOS在穿刺组表达上升，经SCH79797处理后回落；CD163表达在各组间无显著变化，表明PAR1拮抗剂主要通过抑制M1型极化发挥保护作用。

凝血酶诱导VEGF表达与血管新生

在体外培养模型中，凝血酶刺激显著提升VEGF mRNA水平及蛋白分泌，而PAR1拮抗剂可逆转该效应。体内实验显示，穿刺组椎间盘VEGF和血小板-内皮细胞粘附分子CD31表达增强，尤其在髓核周围区域，SCH79797处理则明显抑制该现象，表明凝血酶-PAR1通路在椎间盘血管新生中起关键作用。

讨论

本研究通过体外和体内模型证实，凝血酶通过PAR1受体激活MCP-1表达，招募巨噬细胞并促使向M1表型极化，进而增强VEGF表达与血管新生，最终导致椎间盘基质降解。使用临床已批准的PAR1拮抗剂vorapaxar（SCH79797）可有效阻断上述过程，为治疗退行性椎间盘疾病提供了新的治疗策略。本研究也存在一定局限性，包括小鼠模型与人类直立姿态的生物学差异，以及骨髓污染可能对巨噬细胞检测结果的影响。未来需进一步开展临床转化研究，验证PAR1拮抗剂在人类椎间盘退变治疗中的潜力。