CRACI测序技术实现碱基分辨率定量解析RNA二氢尿苷的转录组分布图谱

本刊推荐：为解决RNA二氢尿苷（D）修饰检测灵敏度低、定量难的问题，研究团队开发了化学还原辅助胞嘧啶掺入测序技术（CRACI），首次在哺乳动物和植物中实现了转录组范围内D修饰的单碱基分辨率定量定位，揭示了线粒体tRNA中D修饰的分布特征并鉴定出DUS2L为人类线粒体tRNA的修饰酶，为研究D修饰的生物学功能提供了强大平台。

　　

在RNA修饰研究领域，二氢尿苷（Dihydrouridine, D）作为最丰富的转录后修饰之一，长期以来因检测技术的局限而笼罩在神秘面纱中。这种由尿苷5,6位双键还原形成的饱和嘧啶环结构，以其独特的非芳香性特征显著影响RNA分子的柔韧性和折叠动力学。尽管早在数十年前科学家就在细菌、真核生物和植物tRNA中发现了D修饰的存在，但哺乳动物中D修饰的全景分布、动态调控及其功能始终未能阐明。更令人惊讶的是，科学界甚至连tRNA中D位点的准确分布和修饰化学计量都缺乏系统性的认知。

传统的D检测方法如AlkAniline-Seq、Rho-seq和D-seq依赖于逆转录终止信号，存在灵敏度低、背景噪声高的问题，特别是在tRNA等高度修饰的小RNA区域几乎无法有效检测。与此同时，同样是尿苷修饰的假尿苷（Ψ）和m⁶A修饰研究却因测序技术的突破而飞速发展。这种技术瓶颈严重制约了科学家对D修饰生物学功能的深入探索，包括其在不同物种中的分布规律、修饰酶的特异性以及与人类疾病的关联机制。

针对这一挑战，芝加哥大学化学系和霍华德·休斯医学研究所的Cheng-Wei Ju、Han Li等研究人员在《Nature Communications》上发表了突破性研究成果。团队开发了一种名为化学还原辅助胞嘧啶掺入测序（Chemical Reduction Assisted Cytosine Incorporation sequencing, CRACI）的革命性技术，首次实现了全转录组范围内D修饰的单碱基分辨率定量定位。

CRACI技术的核心创新在于巧妙利用KBH₄将D还原为四氢尿苷，随后通过优化dGTP/dNTP比例促使HIV逆转录酶在还原位点产生特异的T→C错配，从而将传统的RT终止信号转化为可定量的错配信号。这种方法不仅大幅提高了检测灵敏度，还能准确识别密集分布的多个D修饰位点。

研究人员运用该技术成功绘制了哺乳动物和植物细胞质与线粒体tRNA中D修饰的定量图谱。在人类HepG2细胞中，他们精确鉴定出46种不同细胞质tRNA中的D修饰位点，发现D修饰特异性地位于tRNA的D-loop区域（位置16、17、20、20a、20b和47），其中D16和D17显示超过70%的高修饰化学计量，D20和D47多在60%以上，而D20a的修饰水平则在20%-100%之间变化。

更令人振奋的是，团队首次在线粒体tRNA中发现了D修饰的存在，鉴定出mt-tRNA^Asn D17、mt-tRNA^Asn D20、mt-tRNA^Gln D20和mt-tRNA^Leu(UUR) D20五个修饰位点，其中三个位点的修饰程度高达90%以上。

通过siRNA敲低实验，研究人员系统解析了四种DUS酶（DUS1L、DUS2L、DUS3L和DUS4L）的底物特异性：DUS1L负责D16和D17的安装，DUS2L催化D20形成，DUS3L介导D47修饰，而DUS4L专门负责D20a位点。特别重要的是，他们发现DUS2L是线粒体tRNA中D修饰的关键"书写器"（writer）蛋白。

研究还揭示了D修饰间有趣的顺式调控现象：在同时含有D20和D20a的tRNA中，D20a的缺失反而增强了D20的修饰水平，表明未修饰的U20a可能促进DUS2L的招募，而预先存在的D20a则对相邻D20位点起到负调控作用。这种同一修饰在不同位点间的相互调控在RNA修饰领域极为罕见。

跨物种比较显示，小鼠胚胎干细胞（mESC）的D修饰分布与人类高度相似，而拟南芥中则呈现出更丰富的D修饰多样性：不仅在细胞质tRNA中检测到D16、D17、D20和D47修饰，在线粒体tRNA中发现了更多D-loop修饰位点，甚至在叶绿体tRNA和23S rRNA中也鉴定出高修饰程度的D位点。

最后，研究人员探讨了mRNA中是否存在D修饰这一长期争议的问题。通过与体外转录（IVT）RNA的对比，他们在HepG2 mRNA中鉴定出8个可信的D位点，修饰程度在10%-40%之间，证实了mRNA中确实存在D修饰，但频率极低且分布有限。

关键技术方法包括：CRACI测序技术（基于KBH₄化学还原和优化dGTP/dNTP比例的逆转录反应）、LC-MS/MS质谱分析验证、siRNA基因敲低、体外转录RNA对照系统、线粒体tRNA富集（使用链霉亲和素磁珠和生物素化探针）以及高通量测序数据分析流程。

研究结论表明，CRACI技术为D修饰研究提供了前所未有的强大工具，首次实现了全转录组范围的单碱基分辨率定量分析。研究发现大多数D修饰对tRNA稳定性影响有限，但D20a修饰例外；揭示了DUS2L作为线粒体tRNAD修饰的关键酶；发现了相邻D位点间独特的顺式调控机制；证实了mRNA中存在稀有D修饰。这些发现不仅填补了RNA修饰研究领域的重要空白，为理解D修饰的进化保守性和功能多样性提供了深刻见解，更为研究D修饰在人类疾病中的作用奠定了基础。该技术平台将极大地推动D生物学在各个物种中的功能研究，特别是在癌症、神经退行性疾病等与RNA修饰密切相关的病理过程中的作用机制探索。