GNP2自然变异通过磷酸化稳定Gnp4/LAX2增强水稻穗粒数提升产量的分子机制

为解决水稻穗粒数(GNP)遗传调控机制不清的问题，研究人员开展全基因组关联分析(GWAS)，鉴定出bZIP转录因子GNP5通过结合GNP2启动子G-box motif调控GSK3-like激酶GNP2表达，GNP2磷酸化并稳定Gnp4/LAX2蛋白，进而调控穗发育相关转录因子活性，最终显著增加穗粒数和产量约10%，为水稻高产育种提供新策略。

　　

水稻作为全球近一半人口的主食，其产量提升始终是农业研究的核心课题。穗粒数(Grain Number per Panicle, GNP)是决定水稻产量的三大关键因素之一，然而其遗传调控机制复杂，长期以来缺乏有效的育种靶点。虽然传统遗传定位已发现部分调控基因，如Gn1a、LOG等细胞分裂素相关基因，LAX1、LAX2等穗型调控基因，但自然变异中蕴藏的遗传潜力仍未充分挖掘。更值得注意的是，GSK3-like激酶家族作为BR信号通路的关键负调控因子，其在水稻穗粒数形成中的转录调控机制至今不明。

为解决这一难题，中国农业大学张战英团队对496份全球水稻种质进行全基因组关联分析(GWAS)，在南宁和玉溪两地鉴定出6个和13个显著GNP关联位点，其中qGNP1和qGNP4a在两个环境中稳定出现。通过连锁不平衡分析，研究人员将候选基因锁定为LOC_Os01g10840和LOC_Os04g10260，分别命名为GNP2和GNP5。

研究采用CRISPR/Cas9技术构建突变体，发现gnp2-ko植株穗粒数、穗二次枝梗数和单株产量显著降低，而GNP2过表达株系则呈现穗粒数增加10%以上的表型。gnp5-ko植株虽籽粒增大但穗粒数锐减，GNP5过表达则全面提升穗部性状。这表明GNP2和GNP5是调控穗粒数的关键基因。

深入机制研究发现，GNP2启动子区变异位点S5779181（G-box motif）是关键功能变异。携带G碱基的pGNP2(G)单倍型比A碱基的pGNP2(A)具有更高启动子活性，导致GNP2表达量和穗粒数显著提升。实验证明bZIP转录因子GNP5直接结合该位点，且与pGNP2(G)亲和力更强。酵母单杂、EMSA和ChIP-qPCR均验证GNP5通过结合GNP2启动子调控其表达。

GNP2编码的GSK3-like激酶与穗发育关键蛋白Gnp4/LAX2相互作用。体外pull-down、体内Co-IP、BiFC和LCI实验证实两者直接结合。磷酸化实验显示GNP2特异性磷酸化Gnp4/LAX2的Thr175和Thr262位点。细胞降解实验表明磷酸化修饰显著增强Gnp4/LAX2蛋白稳定性。

RNA-seq分析发现GNP2-Gnp4/LAX2模块调控大量转录因子。酵母筛库证实Gnp4/LAX2与LAX1、MOG1、Ghd2等正向调控因子及GL6、OsMADS15、An-1等负向调控因子互作。双荧光素酶实验显示磷酸化Gnp4/LAX2^T175,262D可增强正向因子转录活性、抑制负向因子活性。

单倍型分析发现GNP5-Hap1与GNP2-Hap-G的组合（Type I）为最优单倍型，能显著提升籼稻和粳稻穗粒数。地理分布分析显示Type I在籼稻中广泛存在，但在粳稻改良品种中仅占7.5%-60.7%，具有巨大育种潜力。田间试验表明GNP2过表达株系增产10.3%-11.4%，GNP5过表达株系增产17.0%-20.3%。

本研究主要采用以下关键技术：1) 496份全球种质资源的全基因组关联分析(GWAS)；2) CRISPR/Cas9基因编辑构建多基因突变体；3) 酵母单杂(Y1H)和电泳迁移率(EMSA)验证转录因子结合；4) 染色质免疫沉淀(ChIP-qPCR)分析体内结合能力；5) 体外磷酸化检测和质谱(LC-MS/MS)鉴定磷酸化位点；6) 双分子荧光互补(BiFC)和荧光素酶互补(LCI)验证蛋白互作；7) 转录组测序(RNA-seq)分析下游通路。

GNP2和GNP5的鉴定与功能验证

通过GWAS分析496份水稻种质，发现染色体1和4上存在稳定GNP关联位点qGNP1和qGNP4a。LD分析将候选基因缩小至LOC_Os01g10840（GNP2）和LOC_Os04g10260（GNP5）。GNP2编码GSK3-like激酶，GNP5编码bZIP转录因子。敲除GNP2导致穗粒数减少，过表达则增加穗粒数和产量；GNP5敲除虽增加粒重但大幅降低穗粒数，过表达则全面改善穗型。

GNP2启动子自然变异调控穗粒数

GNP2启动子区S5779181位点（G-box）是关键变异位点。携带G碱基的pGNP2(G)单倍型启动子活性、GNP2表达量和穗粒数均显著高于A碱基型。回补实验证实pGNP2(G)能完全恢复gnp2-ko表型，而pGNP2(A)仅部分恢复。

GNP5转录调控GNP2表达

GNP5直接结合GNP2启动子G-box motif，与pGNP2(G)亲和力更强。Y1H、双荧光素酶、EMSA和ChIP-qPCR均证实GNP5通过该位点激活GNP2转录。双突变体gnp5-ko gnp2-ko表型与gnp2-ko相似，证明GNP5位于GNP2上游。

GNP2磷酸化并稳定Gnp4/LAX2

GNP2与穗发育关键蛋白Gnp4/LAX2互作，并磷酸化其Thr175和Thr262位点。磷酸化修饰显著增强Gnp4/LAX2稳定性。双突变体gnp2-ko gnp4/lax2-ko穗粒数低于单突变体，表明两者在同一通路发挥作用。

GNP2-Gnp4/LAX2模块调控转录因子活性

RNA-seq发现GNP2和Gnp4/LAX2共同调控814个差异基因。Gnp4/LAX2与多个穗发育转录因子（LAX1、MOG1、Ghd2、GL6等）互作。磷酸化Gnp4/LAX2^T175,262D显著增强正向因子活性、抑制负向因子活性。回补实验证实磷酸化形式能更有效恢复穗粒数表型。

优良单倍型鉴定与育种应用

GNP5-Hap1与GNP2-Hap-G组合（Type I）为最优单倍型，能显著提升穗粒数。近等基因系验证表明NIL-Type I比NIL-Type II增产显著。地理分布分析显示Type I在籼稻中广泛分布，但在粳稻尤其是温带粳稻改良品种中比例较低，具有巨大应用潜力。

产量性状综合评价

田间试验表明GNP2过表达株系增产10.3%-11.4%，GNP5过表达株系增产17.0%-20.3%，且不影响其他农艺性状。这为分子育种提供了安全有效的靶点。

本研究

本研究首次揭示GSK3-like激酶GNP2通过磷酸化修饰Gnp4/LAX2调控穗粒数的转录级联机制，解析了GNP5-GNP2-Gnp4/LAX2信号通路的核心作用。发现启动子区自然变异位点S5779181的功能差异，并鉴定出最优单倍型组合Type I。该研究不仅深化了对水稻穗发育分子机制的理解，更为分子设计育种提供了精准靶点和优良等位基因组合，对实现水稻产量突破具有重要理论与实践意义。