细胞通过TM9SF3介导的PI(4,5)P2外翻重塑膜脂拓扑结构以响应胞外酸性微环境

细胞如何响应胞外酸性pH（pHext）尚不完全清楚。本研究通过全基因组筛选发现TM9SF3介导PI(4,5)P2从质膜内叶翻转到外叶，调控斑马鱼原肠胚形成过程中细胞集体迁移和细胞骨架组织。该机制在脊椎动物中保守，为细胞适应环境提供了脂质拓扑调控新范式。

　　

细胞在不断变化的环境中生存，必须时刻感知并适应外界刺激。质膜（Plasma Membrane, PM）作为细胞与外界环境之间的物理屏障，其脂质双分子层的结构和功能对细胞响应外界信号至关重要。磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP₂）是一种多功能磷脂，主要分布在质膜内叶，参与调控肌动蛋白细胞骨架、膜运输、细胞迁移和离子通道活性等多种细胞过程。尽管受体介导的信号转导通路已被广泛研究，但脂质分子本身在响应环境变化中的直接作用仍知之甚少。此外，细胞外pH（pHext）的降低（酸化）常见于缺血、癌症和炎症等病理状况，但细胞如何感知并响应pHext变化，尤其是在早期胚胎发育过程中，仍是一个未解之谜。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员发现细胞能够通过一种前所未有的机制响应胞外酸性pH：即TM9SF3（Transmembrane 9 Superfamily Member 3）介导的PIP₂从质膜内叶到外叶的翻转（translocation）。这一发现不仅揭示了细胞适应酸性微环境的新策略，也拓展了我们对脂质功能多样性的认识。

为了探究细胞是否响应pHext变化而改变质膜脂质分布，研究人员首先以斑马鱼胚胎细胞为模型，利用特异性结合不同脂质的荧光探针进行检测。他们发现，当细胞处于酸性环境（pH 7.2）时，PIP₂会出现在质膜外叶，而在碱性条件（pH 8.1）下则不会。这种变化具有特异性，因为其他磷脂如磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）以及其他磷酸肌醇如PI(4)P和PI(3,4,5)P₃均未表现出类似的易位现象。通过使用PIP₂结合缺陷的突变探针以及降低细胞内PIP₂水平（如表达PIP₂磷酸酶INPP5E或激活PLC），他们证实外叶的PIP₂确实来源于内叶，且这一现象在哺乳动物细胞中也保守存在。进一步利用pH敏感荧光蛋白探针（SEpHluorin）进行比率成像，他们发现pHext降低并不会迅速改变细胞内pH（pHint），表明细胞直接感知的是pHext的变化，而非pH梯度。通过使用离子载体消除跨膜pH梯度，他们证明细胞感知的是pH梯度而非pHext绝对值，从而触发PIP₂翻转。

为了鉴定调控这一过程的关键分子，研究人员在293F细胞中进行了全基因组规模的PiggyBac转座子突变筛选，通过多轮荧光激活细胞分选（FACS）富集“低PIP₂暴露”细胞群，并鉴定出TM9SF3基因是PIP₂翻转的必要因子。TM9SF3预测为九次跨膜蛋白，具有较大的胞外结构域。通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，他们在293F和DLD-1细胞中构建了TM9SF3缺失细胞系，并证实TM9SF3缺失完全 abolished pH依赖的PIP₂外翻。值得注意的是，TM9SF3的缺失并不影响细胞内PIP₂的总量或分子种类，表明其特异调控PIP₂的拓扑分布而非合成。细胞表面生物素化实验和免疫荧光显示TM9SF3蛋白定位于质膜和细胞内区室，提示其可能直接参与脂质翻转过程。

研究人员进一步在斑马鱼体内验证了TM9SF3的功能。通过TALEN技术构建了母体-合子tm9sf3突变体，他们发现突变体胚胎在原肠胚形成时期（6-14 hpf）表现出前轴中胚层（prechordal plate, ppl）细胞集体迁移紊乱。利用活体成像和细胞追踪技术，他们发现tm9sf3突变体ppl细胞失去协调性，运动速度更快，轨迹更随机，且细胞间凝聚力下降。细胞骨架分析显示，突变体细胞中磷酸化肌球蛋白（pMLC）和纤维状肌动蛋白（F-actin）的水平降低，且两者在ppl前端和后端的空间分布模式消失，导致细胞边缘出现大量丝状伪足（filopodia）而非正常的膜泡（blebs）和板状伪足（lamellipodia）。这些细胞骨架异常并非由于细胞命运改变、凋亡或增殖差异引起，而是直接源于细胞迁移和粘附特性的失调。

为了探究TM9SF3调控细胞迁移的机制，研究人员通过混合培养实验发现，在酸性条件（pH 7.0）下，野生型ppl细胞表现出比tm9sf3突变体细胞更强的凝聚力，而在pH 8.0时无此差异，表明TM9SF3介导的PIP₂翻转在低pH环境下促进细胞集群行为。他们提出工作模型：在酸性pHext刺激下，TM9SF3激活并促进PIP₂从质膜内叶翻转到外叶，导致内叶PIP₂水平下降，从而降低肌球蛋白活性和细胞间粘附，同时增加肌动蛋白动态性，使细胞迁移增强但协调性丧失。

本研究的主要技术方法包括：利用斑马鱼胚胎和细胞系（293F、DLD-1）作为模型系统；使用基因组编辑技术（TALEN、CRISPR/Cas9）构建突变体；通过全基因组转座子突变筛选和FACS分选鉴定目标基因；采用活细胞成像、比率荧光成像和3D细胞追踪分析细胞行为和pH动态；使用脂质结合探针和生物素化 assay 检测脂质分布和蛋白定位；通过质谱分析脂质组成；利用免疫荧光和Western blotting进行蛋白表达和修饰检测。

研究结果部分通过以下小标题和结论展开：

Translocation of PIP2 to the outer leaflet of the PM in response to a lower pH：发现酸性pHext诱导PIP₂从质膜内叶翻转到外叶，该过程依赖于pH梯度且保守于脊椎动物。

Identification of TM9SF3 as a guardian for asymmetric PIP2 distribution at the PM：全基因组筛选和基因敲除验证TM9SF3是PIP₂翻转的必要因子，不影响PIP₂合成。

TM9SF3 functions under low pH during embryogenesis：斑马鱼tm9sf3突变体胚胎出现ppl细胞迁移紊乱，细胞运动加快但协调性丧失。

TM9SF3 regulates ppl migration in response to pHext by modulating cytoskeletal dynamics：突变体细胞中pMLC和F-actin水平降低，空间分布异常，细胞骨架动态改变。

研究结论与讨论部分强调，TM9SF3介导的PIP₂翻转是细胞响应胞外酸性环境的一种进化保守机制（从盘基网柄菌到 vertebrates）。这不仅揭示了脂质拓扑分布变化作为细胞快速适应环境的新策略，也为理解肿瘤微环境酸化促进癌细胞侵袭和转移提供了新视角（TM9SF3在胃癌和T细胞白血病中高表达）。此外，该研究突破了传统认为脂质功能仅受代谢和 localization 调控的观点，提出了“脂质拓扑功能化”的新概念，即脂分子通过改变其在膜脂双层中的位置而获得新功能，为细胞信号转导和膜生物学研究开辟了新方向。