靶向ROR2的CAR-T细胞疗法：治疗血液瘤与实体瘤的新希望，安全有效

本期推荐：为解决多发性骨髓瘤(MM)和透明细胞肾细胞癌(ccRCC)缺乏有效靶向治疗的难题，研究人员开展针对受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)的CAR-T细胞疗法研究。结果表明，ROR2-CAR T细胞在体外和体内模型中均表现出强大的抗肿瘤活性，且在小鼠中耐受良好，无脱靶毒性。该研究为ROR2作为CAR-T治疗新靶点提供了坚实证据，有望应用于多种ROR2阳性肿瘤的治疗。

　　

癌症免疫治疗领域近年来取得了突破性进展，尤其是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法在血液肿瘤治疗中显示出显著疗效。然而，这种革命性疗法在实体瘤治疗中仍面临巨大挑战，主要障碍包括缺乏合适的肿瘤特异性靶点、肿瘤微环境的免疫抑制以及治疗相关的毒性反应。同时，即便是血液肿瘤，现有靶点如BCMA(BCMA)在多发性骨髓瘤治疗中也存在抗原逃逸和毒性问题，迫切需要开发新的靶向策略。

在这一背景下，受体酪氨酸激酶(RTK)家族成员引起了研究人员的关注。受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)作为一种oncofetal抗原（在胚胎发育阶段表达，成年后正常组织中表达受限的蛋白），在多种癌症中过度表达，与肿瘤侵袭性和转移能力相关，而在健康成人组织中表达高度受限，这使其成为理想的免疫治疗靶点。Weber等人发表在《Cell Reports Medicine》上的研究，系统探索了ROR2作为CAR-T细胞治疗靶点在血液肿瘤和实体瘤中的应用潜力。

研究人员通过多种技术方法验证了ROR2靶向治疗的可行性和安全性。他们利用公共基因表达数据库(TCGA PanCanAtlas)进行生物信息学分析，评估ROR2在不同癌症类型中的表达及其与预后的关系；通过流式细胞术、免疫组化和dSTORM超分辨率显微镜等技术检测ROR2在肿瘤细胞表面的表达水平；构建第二代ROR2特异性CAR-T细胞（含4-1BB共刺激结构域）；建立异种移植小鼠模型评估体内抗肿瘤效果和安全性；使用来自28例多发性骨髓瘤患者和24例肾癌患者的原代细胞进行体外功能实验。

研究团队首先证实了ROR2在多发性骨髓瘤(MM)中的广泛表达。通过流式细胞术分析28例MM患者的原代细胞，发现82%(23/28)的样本表达ROR2，表达水平从低到高不等。选择U266(高表达)、MM1.S(中表达)和OPM-2(不表达)细胞系作为模型，dSTORM显微镜显示U266细胞表面ROR2密度为6个簇/μm²。

研究人员开发了ROR2特异性CAR-T细胞，该细胞在扩增后未显示TIM-3、LAG-3和PD-1阳性率增加，表明无明显 tonic signaling（CAR分子在无抗原刺激情况下自发激活的现象）。体外实验证实，CD8⁺ ROR2-CAR T细胞能特异性识别和裂解U266和MM1.S细胞，其细胞毒活性与ROR2抗原密度相关。针对原代MM细胞的实验显示，ROR2-CAR T细胞对高、中、低表达ROR2的原代细胞均有效，且在某些情况下甚至超过对U266细胞的活性，表明除CAR识别外，可能还有其他机制参与肿瘤细胞清除。

在U266异种移植模型中，ROR2-CAR T细胞治疗导致83%(10/12)的小鼠达到部分缓解，25%(3/12)达到完全缓解，且这些小鼠长期无瘤生存至实验结束(290天)。治疗显著延长中位总生存期(mOS)从119天至147天。ROR2-CAR T细胞在输注后早期即可在外周血中检测到，并持续存在于血液、骨髓和脾脏中。

安全性评估是本研究的重要环节。研究人员发现ROR2-CAR能识别小鼠Ror2(与人类ROR2有92%序列同源性)，但小鼠实验中未观察到临床毒性迹象。通过qPCR、Western blot和免疫组化分析多种健康组织，发现ROR2/Ror2在子宫组织中有转录本和蛋白表达，但细胞表面表达极低或缺失。流式细胞术显示正常造血细胞中ROR2表达极低，dSTORM检测到浆细胞有微弱信号但低于CAR-T激活阈值(≥30个分子/细胞)。

小鼠

小鼠毒性实验中，输注高剂量ROR2-CAR T细胞(1×10⁷个细胞，约相当于4×10⁸个细胞/kg)后，所有小鼠均耐受良好，无急慢性毒性迹象。组织学分析显示，除ROR2-CAR T细胞组小鼠出现轻度支气管周围浸润外，未见其他组织损伤。特别值得注意的是，所有接受ROR2-CAR T细胞的雌性小鼠子宫组织均未见明显异常。

研究人员进一步探索了ROR2在实体瘤中的治疗潜力。通过分析TCGA数据库，发现ROR2高表达与六种癌症的不良预后显著相关：低级别胶质瘤、甲状腺癌、胃腺癌、膀胱癌、乳头状肾细胞癌(pRCC)和透明细胞肾细胞癌(ccRCC)。在ccRCC中，ROR2表达与患者生存期呈负相关，且与上皮间质转化(EMT)、侵袭性和转移形成等恶性特征正相关。

实验证实786-O(高表达)、RCC4(中表达)、RCC-53(低表达)和Caki-1(不表达)ccRCC细胞系表面ROR2表达梯度。qPCR分析显示96%(23/24)的ccRCC原代样本表达ROR2。免疫组化显示ccRCC中ROR2蛋白表达显著高于pRCC(中位H评分109.4 vs. 14.22)。

功能实验表明ROR2-CAR T细胞能有效裂解ROR2阳性ccRCC细胞系，其活性与抗原密度高度相关。与CD70-CAR T细胞相比，ROR2-CAR T细胞对ROR2⁺CD70⁺的ccRCC细胞系具有相当活性，但对ROR2^-CD70⁺的Caki-1细胞活性较低。

在786-O异种移植模型中，ROR2-CAR T细胞治疗使所有小鼠肿瘤迅速消退，外周血中可检测到CAR-T细胞直至输注后35天。治疗显著延长小鼠中位生存期从52天至84天，但所有小鼠最终出现肿瘤复发。对复发肿瘤的分析显示部分小鼠肿瘤细胞ROR2表达下调，提示可能发生了抗原逃逸。

研究结论表明，ROR2是CAR-T细胞治疗血液肿瘤和实体瘤的有前景靶点。该研究证实了ROR2在MM和ccRCC中的一致表达，以及ROR2-CAR T细胞在体外和体内的强大抗肿瘤活性。更重要的是，治疗在小鼠中耐受良好，无on-target off-tumor毒性（CAR-T细胞攻击表达靶抗原的正常组织引起的毒性）证据，支持ROR2作为oncofetal抗原的安全性特征。

讨论部分强调，与现有靶点如BCMA相比，ROR2具有独特优势：无已知可溶性形式干扰CAR识别，染色体位置(9号染色体长臂)不在MM常见染色体异常区域内，表达模式更为局限。研究还指出了当前局限性，包括未使用免疫健全小鼠模型评估与内源性免疫细胞的相互作用，未测试与检查点抑制剂等联合治疗策略。

这些发现为将ROR2-CAR T细胞推向临床奠定了基础。研究人员表示，基于这些临床前数据，他们正在准备开展针对晚期MM和ccRCC的ROR2-CAR T细胞临床试验。该研究不仅为MM和ccRCC患者提供了新的治疗选择，也为靶向oncofetal抗原的CAR-T疗法开发提供了重要范例，有望推动癌症免疫治疗领域的进一步发展。