肌动蛋白环作为机械屏障在血管内皮抵抗肿瘤侵袭中的作用机制研究

本研究发现血管内皮细胞间缝隙处形成的肌动蛋白环（actin rings）在抵抗肿瘤细胞穿内皮迁移（TEM）中发挥关键机械屏障作用。研究人员通过实验和理论模型证实，该结构的收缩产生显著机械阻力，能有效阻碍肿瘤细胞迁移并诱导其凋亡。研究还揭示了内皮细胞密度和基质刚度对该屏障功能的调控机制，为理解肿瘤转移的力学过程提供了新视角，对开发针对肿瘤侵袭的创新疗法具有重要意义。

　　

在肿瘤转移这一导致癌症相关死亡的主要原因中，肿瘤细胞穿越血管内皮的穿内皮迁移（Transendothelial Migration, TEM）过程至关重要。然而，长期以来该领域的研究主要集中在化学机制，如基因调控和信号通路（如ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1介导的肿瘤-内皮粘附）上，对其中的力学机制理解甚少。例如，肿瘤细胞如何与内皮细胞及细胞外基质（ECM）相互作用？哪些力学因素影响穿内皮迁移的细胞行为？目前缺乏对穿内皮迁移细胞行为的定量理解。

为了探究癌症细胞如何侵袭血管内皮及其与内皮细胞的相互作用，Chaohui Jiang等研究人员设计了一个模型系统，让人脐静脉内皮细胞（HUVECs）形成单层，然后让肿瘤细胞侵袭穿过该细胞层。研究发现，肌动蛋白环（actin rings）在内皮缝隙边缘形成，成为抵抗肿瘤细胞穿透的机械屏障。通过实验方法和理论建模，研究表明肌动蛋白环的收缩产生显著的机械阻力，阻碍肿瘤细胞迁移并促进其凋亡。同时，内皮细胞密度和基质刚度调控肌动蛋白环的形成和功能。较高的内皮细胞密度导致更小的肌动蛋白环和更紧密的细胞间缝隙，增强对肿瘤细胞的机械约束，而基质刚度影响肌动蛋白丝分布，调控内皮的预张力和机械强度。这项研究揭示了肌动蛋白环在调节肿瘤侵袭过程中内皮抵抗力的重要性，为癌症治疗的创新靶点识别提供了潜在途径。该研究发表在《Cell Reports Physical Science》上。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术方法：采用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和稳定转染Lifeact-zsgreen的人结肠腺癌细胞系（LoVo细胞）共培养模型；使用免疫荧光染色标记Paxillin、VE-cadherin等蛋白；应用siRNA转染技术敲低核纤层蛋白A/C（laminA/C）以软化细胞核；通过多聚丙烯酰胺凝胶（PAA gel）制备不同刚度（2.5 kPa、60 kPa和玻璃）的基质；采用傅里叶变换牵引力细胞术（FTTC）测量细胞层内的应力分布；并利用共聚焦显微镜进行动态活细胞成像和三维重建。

研究结果

肿瘤细胞穿内皮迁移的动态过程

研究人员设计了血管内皮细胞形成单层、肿瘤细胞侵袭通过的模型系统。当肿瘤细胞找到合适位置（通常位于两个内皮细胞间的界面）后，先伸出伪足接触内皮细胞，然后将伪足延伸至相邻内皮细胞间的界面。继续侵袭时，肿瘤细胞变形挤压细胞质通过界面缝隙，移动到细胞层下方并在基质上铺展。随后细胞核被拉下跟随细胞质，最终肿瘤细胞完全挤过细胞层，铺展面积达到稳定。通过定义即时铺展指数（ISI），发现细胞体先于细胞核开始铺展，细胞核的最大铺展速度滞后于细胞体。细胞核在侵袭过程中先被拉至细胞体底部，然后在细胞迁移穿过血管内皮层时移回细胞中心。将侵袭过程分为三个阶段，并利用免疫荧光染色标记paxillin，发现肿瘤细胞与基质间的粘附在侵袭过程中逐渐建立。

肿瘤细胞被内皮中的肌动蛋白环结构阻滞

研究发现，在相邻内皮细胞间的侵袭位置界面缝隙周围会形成一种肌动蛋白环样结构，对肿瘤细胞侵袭产生结构阻力。该肌动蛋白环由相邻内皮细胞的肌动蛋白弧构成，类似于伤口愈合过程中的多细胞排列。三维图像显示了肿瘤细胞与肌动蛋白环之间的位置关系。肌动蛋白环单位长度的荧光强度随肿瘤细胞侵袭面积的增加而增加，表明肌动蛋白环结构的形成伴随侵袭过程。分析侵袭面积沿圆周方向的分布，发现侵袭面积密度在60°-90°方向最高，0°-30°方向最小，即缝隙的扩张倾向于沿缝隙短轴方向。肌动蛋白环与肿瘤细胞间的相互作用在阻碍肿瘤细胞侵袭过程中起关键作用。许多肿瘤细胞被肌动蛋白环阻滞，难以通过HUVEC层，即使持续变形和挣扎。肿瘤细胞的细胞核被肌动蛋白环箍住，虽然细胞间粘附在穿内皮迁移中起关键作用，但免疫荧光染色显示EPCAM和PECAM-1在TEM位点无特异性表达，与肌动蛋白环无显著共定位。被 trapped 细胞表现出三种不同命运：完全迁移、保持被困和发生凋亡，其中凋亡比例最高。核硬化可抑制侵袭性黑色素瘤细胞的转移，研究人员通过小干扰RNA（siRNA）敲低laminA/C来软化肿瘤细胞核，发现虽然laminA/C敲低组的侵袭比率与阴性对照组和空白对照组无显著差异，但肿瘤细胞被肌动蛋白环阻滞的概率显著降低，同时核软化降低了侵袭后肿瘤细胞核的高度。这些结果表明，细胞核更硬的肿瘤细胞更容易被肌动蛋白环阻滞，而laminA/C敲低细胞在TEM过程中更容易发生凋亡。

内皮细胞密度对肿瘤细胞侵袭的影响

研究发现内皮细胞密度显著影响肿瘤细胞侵袭。通过调节HUVEC单层的细胞密度在441-2,449 cells/mm2范围内，发现单层中肌动蛋白的平均荧光强度随细胞密度增加而增加。HUVEC密度越高，肿瘤细胞的侵袭比率越低；反之，细胞密度越低，肿瘤细胞的侵袭比率越高。HUVEC密度的增加伴随肿瘤细胞侵袭过程中明显的变形和构象变化。分析肌动蛋白环形成的概率，发现密度较高的组（1,250-2,000 n/mm2）比较低密度组（500-1,250 n/mm2）表现出更大的肌动蛋白环形成可能性，且500-1,250 n/mm2组的肌动蛋白环面积显著大于1,250-2,000 n/mm2组。

肿瘤细胞穿内皮迁移中肌动蛋白动力学/收缩性的作用

为探究肌动蛋白细胞骨架对肿瘤细胞侵袭的作用，研究人员用2μM细胞松弛素D（cytoD）处理肿瘤细胞，发现大多数肿瘤细胞在药物处理后不再有伪足伸出，肿瘤细胞的侵袭比率显著降低。用10μM NSC23766和ML141分别抑制板状伪足和丝状伪足的形成，发现处理ML141后侵袭过程中几乎无丝状突起形成，在高HUVEC密度下肿瘤细胞侵袭能力显著降低，而在低密度下影响较小。用NSC23766处理后几乎无板状伪足形成，但形成丰富的丝状伪足突起，同样在高细胞密度下肿瘤细胞侵袭能力显著降低，但在低细胞密度下影响较小。用10μM blebbistatin、Y27623、ML7分别抑制肌球蛋白II、ROCK和肌球蛋白轻链激酶，发现肿瘤细胞的侵袭比率显著降低。这些结果表明肌动蛋白聚合和收缩对肿瘤细胞的穿内皮迁移至关重要。

细胞核刚度对肿瘤细胞突起力的影响

为定量分析细胞核刚度对肿瘤细胞侵袭过程的影响，研究人员建立了基于有限元法（FEM）的侵袭模型。模型显示，肿瘤细胞板状伪足内的肌动蛋白丝伸长产生对内皮细胞的突起力，当肿瘤细胞核硬时，肌动蛋白丝伸长产生的内皮细胞边缘应力显著高于细胞核软时，表明更硬的细胞核导致肿瘤细胞产生更高的突起应力。因此，细胞核更硬的肿瘤细胞更可能破坏细胞间连接以创建内皮缝隙。此外，肿瘤细胞的突起力在内皮细胞和基质之间产生额外的牵引力，导致牵引力激增，这种侵袭区域边缘向外的牵引力增加得到了实验的证实。

软基质增强细胞侵袭

为探究基质刚度对肿瘤细胞侵袭的影响，研究人员制备了2.5 kPa和60 kPa聚丙烯酰胺凝胶（PAA gel）及玻璃基质，并在这些基质上接种内皮细胞，研究基质刚度对肿瘤细胞侵袭HUVEC单层的影响。发现肿瘤侵袭比率随基质刚度增加而降低，而肌动蛋白环形成的概率随基质刚度增加而增加。相衬图像显示基质越软，内皮单层的灰度分布越不均匀。荧光图像显示基质越软，肌动蛋白细胞骨架分布越不均匀，同时肌动蛋白段沿细胞边缘的平均曲率增加。软基质上的单层在侧视图图像中表现出更高程度的厚度不均匀性，高度波动随基质刚度增加而减小。VE-cadherin标记结果显示，软基质上的内皮细胞在细胞质中表达更多VE-cadherin而非细胞膜上，推测细胞间界面的VE-cadherin分子被内吞入细胞质，从而增加内皮层通透性并诱导更弱的细胞间粘附。细胞质与细胞膜上VE-cadherin平均强度比值随基质刚度减小而降低。这些结果表明，由于肌动蛋白纤维分布不均匀以及细胞层内应力集中，肿瘤细胞更容易侵袭软基质上的内皮单层，同时细胞间粘附减弱。

内皮单层中应力分析

为理解基质刚度对侵袭比率的机制，研究人员探索了不同刚度基质上内皮层中的应力场。实验显示基质刚度影响细胞层中肌动蛋白细胞骨架的分布，将内皮层建模为具有随机分布肌动蛋白丝包裹体的两相复合材料，将有效模量代入内皮层力平衡方程，计算了圆形内皮层中的应力场。基于测量的牵引力计算了微图案化层中的最大主应力（MPS），显示主应力分布具有从边界向细胞层中心增加的特征。分析侵袭位点的MPS，发现约75%的肿瘤细胞在MPS值高于3.2 kPa时能够侵袭。实验结果显示，软基质上细胞层内侵袭区域（MPS超过3.2 kPa阈值）的比例高于硬基质。理论预测表明，细胞层内侵袭区域比例随肌动蛋白丝密度均方根偏差增加而增加，因此软基质上细胞层内侵袭区域比例高于硬基质。软基质上肌动蛋白丝的高度不均匀性导致主应力分布方差大于硬基质，在细胞层内产生高水平的应力集中，这一发现与实验结果一致。分析主应力分布与肌动蛋白丝密度分布的相关性，发现在最大主应力较高的区域，应力纤维的荧光强度也较高，肌动蛋白纤维荧光与主应力呈正相关，有效杨氏模量与最大主应力之间存在相关性。这些发现进一步强调了基质刚度对肌动蛋白丝分布不均匀性和细胞层内应力场的影响，最终影响肿瘤细胞侵袭。

研究结论与讨论

本研究通过实验和理论建模，揭示了肌动蛋白环作为机械屏障在抵抗肿瘤细胞穿内皮迁移中的关键作用。研究发现，肌动蛋白环的收缩产生显著机械阻力，阻碍肿瘤细胞迁移并诱导其凋亡。内皮细胞密度和基质刚度调控肌动蛋白环的形成和功能，较高细胞密度增强对肿瘤细胞的机械约束，而基质刚度影响肌动蛋白丝分布和内皮预张力。理论模型明确了肿瘤细胞突起力、肌动蛋白环收缩力和组织预张力在调控穿内皮迁移过程中的相互关系。

该研究的重要意义在于首次揭示了肌动蛋白环在肿瘤细胞穿内皮迁移中的机械屏障作用，提供了对肿瘤转移中力学过程的新理解。研究发现通过调节内皮细胞密度、基质刚度和细胞核刚度等因素，可以影响肿瘤细胞的侵袭能力，为开发针对肿瘤侵袭的创新疗法提供了潜在靶点。例如，靶向肌动蛋白环的收缩性或调节内皮层的力学性质可能成为抑制肿瘤转移的新策略。

总之，该研究发现了肿瘤细胞穿内皮迁移中的攻击-防御机制，包括破坏内皮层细胞间连接形成细胞间缝隙、肌动蛋白环在肿瘤细胞周围缝隙边缘形成、以及肿瘤细胞挤压通过细胞间缝隙等过程。通过分析肿瘤细胞与内皮细胞层相互作用的力学行为，揭示了穿内皮迁移的潜在机制及相关影响因素，为癌症治疗新方法的开发提供了重要指导。