体细胞突变积累模式揭示非癌细胞中负向选择的存在：SNV与INDEL的差异动力学

为探究随机体细胞突变是否影响细胞功能（非克隆扩增所致），研究人员利用DNA错配修复缺陷（Msh2-/-）小鼠模型开展体外纤维细胞传代研究。通过单细胞全基因组测序（scWGS）发现，SNV（单核苷酸变异）呈线性积累而INDEL（小插入/缺失）趋于平台期，证明基因组范围内存在负向选择，防止有害突变积累。该研究为体细胞突变在衰老相关功能衰退中的因果作用提供关键证据。

　　

随着年龄增长，人体组织中的体细胞突变不断积累，其中部分突变通过克隆扩增引发癌症或其他疾病。然而，若缺乏克隆扩增，随机突变积累是否影响细胞功能，仍是未解之谜。上世纪50年代起，科学界便提出体细胞突变可能是衰老与癌症的诱因，但受限于技术，难以精准检测非克隆性突变。近年来，高精度单细胞全基因组测序（scWGS）技术的发展，使得在多种人类细胞中量化年龄相关的突变负荷成为可能，结果证实突变数量随年龄增加，但功能影响尚不明确。

若突变积累确是衰老的成因，细胞理应有其耐受上限。为验证这一假说，研究人员利用错配修复（MMR）缺陷的Msh2^-/-小鼠模型，分离其肺成纤维细胞进行长期体外传代培养。Msh2蛋白是MutSα和MutSβ复合物的关键组分，负责纠正DNA复制过程中的碱基错配和小插入/缺失错配。Msh2缺陷会导致突变频率急剧上升和癌症风险显著增加，且此类小鼠寿命大幅缩短，提示MMR功能与寿命存在关联。

通过单细胞全基因组测序分析传代过程中的突变积累，研究发现：在Msh2^-/-细胞中，单核苷酸变异（SNV）持续线性增加，直至超过5万个/细胞，远高于正常衰老组织中的负荷；而小插入与缺失（INDEL）则在野生型和Msh2^-/-细胞中分别于约600和1.6万处达到平台期。这一差异提示INDEL可能受到更强的负向选择。进一步分析显示，在进化保守位点，INDEL的发生频率显著低于随机预期，且功能丧失性突变（如移码INDEL、终止增益/丢失SNV）的数量也明显少于预期，证明负向选择在防止有害突变积累中起关键作用。

此外，研究还观察到不同细胞株系在传代过程中出现独特的突变特征谱和突变热点，并伴随显著的克隆扩增。这些现象表明，阳性选择也在发挥作用，某些突变可能通过促进细胞生长或存活而被筛选出来。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）进一步验证了不同细胞簇的存在及其特异性基因突变，如Med29、Ppp2r1a等与转录调控和细胞生长相关的基因。

该研究首次在体外模型中系统揭示体细胞突变积累的选择压力动态，证明即使在高突变负荷下，细胞仍可通过负向和阳性选择维持生长，但这一机制在体内衰老过程中可能难以实现。结果支持体细胞突变作为年龄相关功能衰退的潜在驱动因素，为理解衰老机制提供重要依据。论文发表于《The Innovation》期刊。

研究采用以下关键技术方法：从Msh2^-/-及其野生型同窝小鼠（4-5月龄）分离原代肺成纤维细胞进行25次传代培养；通过单细胞多位移扩增（SCMDA）和单细胞全基因组测序（scWGS）检测体细胞突变；使用SCcaller软件进行突变识别，并与对应鼠尾样本的批量测序数据比对以过滤胚系多态性；利用PhyloP评分分析进化保守性与加速位点；通过批量与单细胞RNA测序（scRNA-seq）评估基因表达与突变转录本验证；应用MutationalPatterns软件进行突变特征提取与COSMIC数据库比对。

Somatic mutation burden in Msh2^-/- mouse fibroblasts

研究首先验证了Msh2^-/-小鼠基因型，并分离肺成纤维细胞进行长期传代。细胞生长速率在两种基因型间无显著差异，但Msh2^-/-细胞在传代后期凋亡比例略高。scWGS分析显示，野生型细胞中SNV负荷从P5的3,618±1,185/细胞增加至P5的5,817±1,623/细胞，突变率约8.2×10^-9/bp/有丝分裂。Msh2^-/-细胞中，SNV从P5的16,080±5,381/细胞增至P25的53,146±24,701/细胞，且无平台期迹象。相反，INDEL在野生型细胞中无显著增加，在Msh2^-/-细胞中于P15达到约1.6万/细胞后进入平台期。

Genome-wide selection against damaging mutations

为评估选择压力，研究人员计算了INDEL与SNV的数量比，发现该比值在传代过程中显著下降，表明对INDEL的负向选择更强。通过PhyloP评分分析进化保守位点，发现INDEL在保守位点的比例显著低于随机预期，而SNV无此现象。对蛋白质编码区的分析显示，非同义替换与同义替换的比值在两种基因型中均与随机预期无异，但功能丧失性突变（如移码INDEL、终止增益/丢失SNV）的数量显著低于预期，证实负向选择主要针对严重有害突变。

Each Msh2^-/- cell strain acquires common and unique mutational signatures during passaging

突变特征分析揭示了三种SNV特征：SBS-A（未见于COSMIC数据库，可能与复制错误相关）、SBS26样和SBS44样（均与MMR缺陷相关）。不同Msh2^-/-细胞株系表现出特征比例差异，提示次级修饰突变的影响。INDEL特征分析发现ID2样特征（单碱基T缺失于重复序列）主导Msh2^-/-细胞，而IDA新特征多见于野生型细胞。

Hotspots, mutational overlap, and positive selection

突变热点分析显示，Msh2^-/-细胞的热点数量显著多于野生型，且不同株系热点分布各异。突变重叠率随传代大幅增加，表明克隆扩增发生。其中，Msh2A株系在chr17区域出现超级热点，而chr1区域的热点见于多个株系。多个重叠突变位于癌症驱动基因（如Plcg1、Mtor、Ccnd1），可能通过促进生长优势被阳性选择。scRNA-seq证实了P25时Msh2^-/-细胞形成转录组 distinct 簇，并与特定基因突变（如Med29、Ppp2r1a）相关联。

研究结论表明，体细胞突变在MMR缺陷细胞中可积累至极高水平，但通过负向选择（尤其针对INDEL和功能丧失性突变）和克隆扩增（阳性选择），细胞仍可维持生长。然而，体内衰老组织缺乏类似选择机制，突变积累可能最终导致功能衰退。该工作为体细胞突变作为衰老驱动因素提供了有力证据，并强调选择压力在突变耐受中的关键作用。