氮代谢酸化触发产油酵母胞外生物聚合物合成：红酵母胞外多糖生产机制与应用潜力

本研究系统探讨了产油酵母Rhodotorula toruloides CCT0783在氮代谢诱导的培养基酸化条件下胞外多糖（EPS）的生物合成机制。通过碳氮比调控实验证实无机氮代谢导致的pH下降（至约2.0）是EPS产生的关键触发因素，最大产量达5.84 g/L。结合FTIR和GC-MS技术解析了EPS的化学组成（葡萄糖88.83%、半乳糖5.50%、甘露糖4.80%），并通过比较基因组学绘制了潜在的EPS生物合成与转运通路。该研究为开发红酵母作为兼具胞内（脂质、类胡萝卜素）与胞外生物聚合物生产的微生物细胞工厂提供了理论基础。

　　

引言

Rhodotorula toruloides作为一种担子菌门产油酵母，以其天然产生类胡萝卜素和中性脂质的能力而闻名。尽管该酵母在胞内生物产品生产方面取得显著进展，但其作为胞外生物聚合物生产者的潜力尚未被充分探索。研究观察到CCT0783菌株在实验室条件下形成细胞聚集体，这暗示可能存在胞外聚合物物质的产生。

材料与方法

研究采用R. toruloides CCT0783菌株，在化学限定培养基中进行培养实验。通过高效液相色谱（HPLC）监测葡萄糖和乙醇浓度，pH计测量培养基酸化情况，干重法测定生物量。胞外多糖（EPS）采用乙醇沉淀法提取，并通过阿尔新蓝染色进行定性验证。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术用于EPS的化学表征。比较基因组学分析采用Braker3等工具对CCT0783基因组进行功能注释，并通过同源性比对映射EPS生物合成与转运途径。

结果

表征红酵母胞外多糖

阿尔新蓝染色显示阳性结果，表明存在阴离子多糖。FTIR光谱显示典型多糖特征峰：O-H伸缩振动（3,244 cm^-1）、脂肪族C-H伸缩振动（2,926和2,882 cm^-1）以及糖苷键特征峰（950-800 cm^-1）。GC-MS分析揭示EPS的单糖组成为：葡萄糖（88.83% ± 4.87%）、半乳糖（5.50% ± 1.50%）、甘露糖（4.80% ± 1.57%）以及少量木糖和阿拉伯糖（0.87% ± 0.04%）。Bradford检测显示蛋白质含量占干重的1.0%。

评估EPS生物合成条件

研究发现钾盐补充（KCl, 0.1 mol/L）虽抑制细胞聚集但使EPS产量降低50%以上。以乙醇为碳源时未检测到EPS产生，表明糖酵解途径为EPS合成提供碳骨架。在不同碳氮比（C:N）实验中，当葡萄糖浓度从20 g/L增至120 g/L（铵盐浓度固定5 g/L），生物量从8.47增至13.23 g/L，EPS产量从1.44显著提高至5.84 g/L。时间序列显示EPS主要在生产稳定期合成，伴随pH从初始4.79降至1.86。

探究碳氮比、氮源和pH对EPS生产的贡献

使用有机氮源（尿素或YPD培养基）时，即使调整初始pH至3.0，也未检测到EPS产生，且培养基pH最终升高至7.0以上。相反，无机氮源（硫酸铵）培养时，培养基pH均下降至2.0以下，且EPS产量与C:N比呈正相关。在缓冲培养基（初始pH 6.88）中未检测到EPS，表明酸性环境（pH ≈ 2.0）是EPS产生的必要条件。比生产量最高达0.48 g_EPS/g_DCW（C:N=52.8）。

红酵母菌株比较分析及推定EPS生物合成途径

通过比较基因组学鉴定出与核苷酸糖（NDP sugars）合成、糖基转移酶和核苷酸糖转运体（NSTs）相关的基因，与参考菌株NP11和IFO0880的序列相似度达83%-100%。 proteomics数据显示，在EPS诱导条件下，V型H⁺-ATP酶显著上调，而部分糖基转移酶表达下调。推定的EPS生物合成途径涉及葡萄糖-6-磷酸通过UDP-葡萄糖和GDP-甘露糖等活化糖供体转化为多糖聚合物。

揭示pH在生物聚合物生产中的作用

无机氮代谢与培养基酸化及EPS生产同时发生。鉴定到多个与pH调控相关的基因：质膜H⁺-ATP酶（Pma1）、液泡H⁺-ATP酶（Vph1/Stv1）及阳离子/H⁺逆向转运蛋白（Nha1, Kha1, Nhx1）。铵盐消耗导致质子外排和培养基酸化，这可能通过影响酶活性和膜转运过程触发EPS生物合成。

讨论

本研究首次系统证实R. toruloides CCT0783在无机氮源导致的酸性环境（pH ≈ 2.0）中产生以葡萄糖为主的胞外多糖。EPS产量与碳氮比呈正相关，最高达5.84 g/L，与文献报道的其他红酵母产量相当（如R. bacarum 54 g/L）。研究通过多组学分析揭示了氮代谢-pH调控-EPS生产的关联机制，并绘制了完整的EPS生物合成与转运通路框架。红酵母EPS具有乳化、凝胶化和抗氧化等特性，在食品、医药和材料领域具有应用潜力。未来研究可聚焦于：系统生物学解析调控网络、过程参数优化、EPS理化性质精细表征以及代谢工程改造提升产量。

致谢

研究得到爱沙尼亚研究委员会（PRG1101）、欧盟地平线欧洲计划（101060066）及奥地利政府就业服务局（AMS）等基金支持。