台湾原生布氏树蛙与外来大头树蛙的微卫星标记开发及其在种群遗传学研究中的应用

本研究针对台湾外来入侵物种大头树蛙(Polypedates megacephalus)对原生种布氏树蛙(P. braueri)的潜在威胁，成功开发了10个多态性微卫星位点，其中7个位点可实现跨物种扩增。这些标记为两种树蛙的遗传多样性分析、种群结构比较及入侵生态学研究提供了重要工具，对保护台湾两栖动物多样性具有重要意义。

　　

在全球生物多样性面临严峻挑战的今天，外来入侵物种已成为威胁生态系统健康的重要因素。两栖动物作为环境变化的敏感指示剂，其入侵现象尤为值得关注。根据国际自然保护联盟（IUCN）的统计，全球已有13种两栖动物被确认为入侵物种，而这个数字随着人类活动加剧和全球贸易往来正在持续增加。岛屿生态系统由于其独特的生态特性，更容易受到外来物种的入侵威胁，台湾作为一个生物多样性热点地区，正面临着这样的挑战。

2006年，台湾台中市首次记录到外来物种大头树蛙（Polypedates megacephalus）的踪迹。这种与台湾原生种布氏树蛙（Polypedates braueri）亲缘关系密切的物种，在接下来的数年间快速扩张，遍布台湾低地地区。研究表明，大头树蛙不仅捕食当地原生两栖动物和爬行动物，如小雨蛙（Microhyla fissipes）、斯文豪氏攀蜥（Japalura swinhonis）和琉球蝎虎（Gekko hokouensis），还与原生物种争夺食物资源，更令人担忧的是，它具有更高的繁殖潜力（平均产卵量639粒，而布氏树蛙仅为349粒）和在食物有限条件下蝌蚪的竞争优势。这些特性使得大头树蛙可能通过生态位替代的方式排挤原生种，对台湾的生物多样性构成严重威胁。

为了深入了解这两种树蛙的种群遗传结构，评估入侵物种对原生种的潜在影响，研究人员迫切需要可靠的遗传标记工具。虽然新一代测序技术日益普及，但微卫星位点（microsatellite loci）作为高分辨率的核遗传标记，在种群和保护遗传学研究中仍然具有重要价值。为此，本研究旨在开发布氏树蛙的特异性微卫星标记，并测试这些标记在外来物种大头树蛙中的跨物种扩增效果，为后续的种群遗传学研究提供技术支持。

本研究主要采用了以下几个关键技术方法：首先从台湾师范大学华林实验林场采集了30个布氏树蛙样本，采用趾剪取法获取组织样本；使用MasterPure? Complete DNA and RNA Purification Kit进行基因组DNA提取；通过富集法分离微卫星序列，使用包括(AC)₁₀、(TC)₁₀等多种探针进行杂交筛选；利用Primer 3软件设计引物；采用荧光标记PCR和毛细管电泳技术进行基因分型；使用GenAlEx ver. 6.5进行遗传多样性参数计算，包括等位基因数(N_A)、观察杂合度(H_O)和期望杂合度(H_E)等；通过Genepop和MICRO-CHECKER软件进行Hardy-Weinberg平衡检验和零等位基因检测。

结果

微卫星位点的分离与特征

研究人员成功从布氏树蛙中分离并表征了10个多态性微卫星位点。这些位点的等位基因数从2到19不等，平均每个位点有9.8个等位基因。观察杂合度范围在0.200到1.000之间，期望杂合度范围在0.180到0.916之间。所有位点均符合Hardy-Weinberg平衡，且没有检测到零等位基因。尽管在Pb327与Pb284和Pb360之间发现了显著的连锁不平衡，但排除Pb327后，其余位点之间没有检测到连锁现象。基于10个位点的联合概率身份值（PI）为4.8×10^-13，表明这些标记具有极高的个体识别能力。

跨物种扩增

在43个大头树蛙样本中，10个位点中有7个成功实现了跨物种扩增。其中5个位点（Pb168、Pb214、Pb284、Pb293、Pb327）表现出多态性，2个位点（Pb213、Pb360）没有变异。对27个成功在所有5个多态性位点完成基因分型的大头树蛙个体进行分析发现，每个位点的等位基因数在4到11之间，平均为8.0。观察杂合度范围在0.185到0.741之间，期望杂合度范围在0.370到0.848之间。基于这5个位点的联合概率身份值为8.9×10^-5。

讨论与结论

本研究成功开发了10个具有高度多态性的微卫星标记，为布氏树蛙的种群遗传学研究提供了有力工具。这些标记显示出了极高的个体识别能力，概率身份值低至3.0×10^-11（基于9个位点）和4.8×10^-13（基于10个位点），表明它们不仅适用于种群水平的遗传研究，如保护遗传学和种群结构分析，也适用于个体水平的应用，如个体识别和亲缘关系分析。

跨物种扩增结果表明，这些标记中的7个能够成功应用于大头树蛙的遗传分析，其中5个保持多态性。值得注意的是，在大头树蛙中，这些位点显示的等位基因数量较少，遗传多样性相对较低，这可能反映了入侵过程中的瓶颈效应、样本中近亲个体的存在或等位基因频率分布不均等因素。尽管如此，这些标记仍然为比较两种树蛙的遗传多样性、种群结构和潜在的基因渗入现象提供了重要手段。

本研究开发的微卫星标记具有重要的理论和实践意义。在理论层面，它们为研究入侵物种的遗传适应机制、种群扩张历史以及与原生物种的相互作用提供了工具；在实践层面，这些标记可用于监测两种树蛙的种群动态，评估保护措施的有效性，并为制定科学的管理策略提供依据。特别是在全球气候变化和生物入侵加剧的背景下，这种针对特定地区、特定物种的遗传工具开发显得尤为宝贵。

该研究发表在《Biodiversity Data Journal》上，不仅为台湾地区两栖动物保护提供了具体的技术支持，也为全球类似生态系统的入侵生物学研究提供了可借鉴的方法学范例。随着这些遗传标记的进一步应用，我们有望更深入地理解生物入侵的遗传学机制，为保护全球生物多样性做出贡献。