一种基于核磁共振（NMR）的简化方法，用于确定醛糖单糖的绝对构型

《Carbohydrate Research》：A Simplified NMR-based Method to Assign the Absolute Configuration of Aldose Monosaccharides.

单糖绝对构型通过L-半胱氨酸与D?O反应生成噻唑啉二异构体，结合HSQC NMR分析H-1-C-1关联确定构型，成功应用于gellan、xanthan多糖及frost grape多糖中阿拉伯糖残基的构型解析。

　　本文探讨了一种简便且基于水的分析方法，用于确定醛糖单糖的绝对构型，这在糖类分析中是一项关键任务。此方法利用醛糖单糖对映体与L-半胱氨酸（一种易于获得的立体化学氨基酸）反应，形成环状硫唑啉衍生物。这些衍生物可以通过异核单量子相干（HSQC）核磁共振（NMR）光谱进行分析，特别关注的是H-1与C-1的氢-碳单键相关性。这种NMR技术提供了必要的数据，以确定原始单糖的绝对构型。文章还通过多个单糖的D-/L对映体对进行了实例分析，并应用该技术确定了复杂多糖（如结冷胶和黄原胶）的组成立体化学结构。此外，还揭示了从葡萄种属藤蔓中分离出的霜葡萄多糖（FGP）中阿拉伯糖残基的未知立体化学结构。所描述的通用方法被认为对分析糖类化学家在快速确定糖类立体化学结构方面具有重要价值。

糖类是自然界中广泛存在的一类化合物，其中单糖是最基本的结构单元。单糖根据其碳原子数目可以分为三碳糖（丙糖）、四碳糖（丁糖）、五碳糖（戊糖）、六碳糖（己糖）等。在单糖中，根据羟基的位置不同，可以形成不同的立体异构体。对于醛糖单糖，其立体异构体通常被分为D-系列和L-系列，这两种系列的糖在物理性质上几乎相同，唯一的区别在于其旋光性。D-系列的糖在自然界中较为常见，部分原因是D-葡萄糖是光合作用的产物，同时由于选择性针对单糖最终羟基的酶（如差向异构酶和异构酶）较为稀缺。因此，D-系列的糖在自然环境中占据主导地位，而L-系列的糖则较少见。然而，某些单糖，如阿拉伯糖、岩藻糖以及在一定程度上的木糖和鼠李糖，天然状态下可以同时以D-和L-对映体的形式存在，其绝对构型的确定通常较为困难。

传统的确定单糖绝对构型的方法通常需要较大的溶液体积，一般为5-10毫升，这限制了其在小样本分析中的应用。对于较小的样品，通常需要使用手性色谱柱或形成单糖衍生物，这些衍生物可以作为非对映体以实现分离。例如，通过将单糖的二硫代乙醇酸衍生物进行乙酰化或三甲基硅基化处理后，利用气相色谱（GC）进行分析。在某些情况下，手性（环糊精）或非手性（DB-17）GC柱可以用于区分对映体，这取决于单糖的衍生物与GC柱的组合。此外，一些研究者利用超高效液相色谱（UPLC）与二极管阵列检测（DAD）结合四级杆/飞行时间质谱（Q-TOF/MS），并使用L-半胱氨酸甲酯和苯基异硫氰酸酯的衍生化协议来区分单糖的对映体。还有一种方法是通过测量金属结合分析物配体簇离子的解离速率，利用质谱（Cooks方法）进行分析。此外，一些研究者使用手性硼酸衍生受体选择性地结合单糖对映体，从而改变基于萘的荧光检测器的荧光强度。还有一种方法是使用单糖的2-氟苯基腙，通过氟-19核磁共振（NMR）光谱来区分其立体化学结构。

尽管这些方法在确定单糖绝对构型方面非常有效，但它们通常需要专业的技术设备和特定的标准品。为了克服这些局限性，一些研究者提出了一种基于NMR的更简便的方法。这种方法利用单糖与L-半胱氨酸在重水（D?O）中的反应，形成硫唑啉衍生物。通过优化反应条件，包括pH值、试剂质量、浓度、反应时间和温度，研究人员定义了一种称为7-7-7-70的标准反应条件，以提高方法的可重复性。实验结果显示，使用重水作为溶剂获取的HSQC光谱非常适合用于确定复杂混合物中原始醛糖单糖的立体化学结构。该方法不仅适用于22种不同的单糖，包括中性醛己糖和醛戊糖、糖醛酸、6-脱氧糖、氨基糖和6-磷酸糖，还被用于确认两种多糖（结冷胶和黄原胶）的组成立体化学结构，并揭示了霜葡萄多糖（FGP）中阿拉伯糖残基的未知构型。这表明该技术具有较强的稳健性和普遍适用性，可用于分析复杂的糖类结构。

在实验过程中，研究人员使用了高质量的化学品和材料。所有试剂、单糖样品以及黄原胶和结冷胶均从Sigma-Aldrich公司（位于美国密苏里州圣路易斯）获得，并且是市场上可获得的最高质量产品。霜葡萄多糖和一些稀有单糖则来自NCAUR-USDA实验室（位于美国伊利诺伊州皮奥里亚）的糖类收藏。这些材料的纯度和结构通过NMR光谱进行了确认。为了确保实验的准确性，研究人员对反应条件进行了标准化处理。在重水中进行的硫唑啉反应条件被优化为7-7-7-70，以提高方法的可重复性。该反应条件包括特定的pH值、试剂质量、浓度、反应时间和温度，这些条件被用于22种不同的单糖，包括中性醛己糖、醛戊糖、糖醛酸、6-脱氧糖、氨基糖和6-磷酸糖。其中包括六种单糖的D/L对映体对，如岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和葡萄糖。研究人员记录了硫唑啉衍生物和对应原始单糖的氢-1和碳-1的NMR化学位移，以及H-1和H-2之间的耦合常数（J?,?）。这些数据为确定单糖的绝对构型提供了关键信息。

在讨论部分，文章指出，单糖在还原性糖的异头位置形成硫唑啉衍生物会导致环状结构的打开，并在1-位形成新的立体中心。这种反应通常被认为需要酸催化，但也有研究表明，该反应可以在水性条件下进行，并且不需要明显的催化剂。例如，反应首先通过形成席夫碱，随后通过硫醇加成到亚胺键上完成环闭合。这一过程在不同的实验条件下可能会有所不同，但总体上遵循类似的化学机制。通过使用重水作为反应溶剂，研究人员不仅提高了硫唑啉衍生物的溶解性，还避免了残留重水（HDO）对NMR信号的干扰。此外，这种方法结合了2D HSQC NMR技术，显著提高了硫唑啉衍生物的H-1/C-1信号的分辨率，使得在复杂混合物中确定单糖的绝对构型成为可能。

该方法的实验步骤包括样品的制备和反应条件的优化。研究人员将每种待测单糖（7毫克）称量到硼硅酸盐玻璃旋盖反应管中，然后加入相应的试剂。在反应过程中，研究人员通过严格控制pH值、试剂质量、浓度、反应时间和温度，确保反应条件的一致性。为了进一步提高实验的可重复性和准确性，研究人员对反应条件进行了标准化处理。实验结果显示，使用重水作为溶剂不仅提高了硫唑啉衍生物的溶解性，还减少了残留重水对NMR信号的干扰，从而提高了数据的可靠性。此外，该方法的简便性使其在实际应用中更加实用，特别是在处理来自寡糖和多糖酸水解的复杂混合物时。

该方法的优势在于其操作简便、不需要特定的标准品，并且可以在重水中进行。与传统的NMR方法相比，该方法不仅减少了对专业设备的需求，还提高了实验的可重复性和准确性。此外，使用重水作为反应溶剂和NMR溶剂，使得实验过程中可以使用常见且水溶性的L-半胱氨酸氨基酸，而无需使用非标准且较为昂贵的溶剂。这大大降低了实验成本，并提高了实验的实用性。通过使用2D HSQC NMR技术，研究人员能够更清晰地分辨硫唑啉衍生物的H-1/C-1信号，从而更准确地确定原始单糖的绝对构型。

在实验过程中，研究人员还考虑了各种可能的干扰因素。例如，残留重水（HDO）通常会出现在H-1信号的区域，这可能会进一步影响数据的解释。为了克服这一问题，研究人员使用重水作为反应溶剂，从而减少了残留重水对NMR信号的干扰。此外，该方法还优化了反应条件，包括pH值、试剂质量、浓度、反应时间和温度，以确保反应的一致性和可重复性。通过这些优化，研究人员能够更准确地记录硫唑啉衍生物和原始单糖的NMR数据，并据此确定其绝对构型。

该方法的实验结果显示，其在实际应用中具有较高的准确性和可靠性。研究人员对22种不同的单糖进行了实验，包括中性醛己糖、醛戊糖、糖醛酸、6-脱氧糖、氨基糖和6-磷酸糖。其中包括六种单糖的D/L对映体对，如岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖。实验结果表明，该方法能够有效地确定这些单糖的绝对构型，并且适用于复杂多糖的分析。例如，该方法被用于确认结冷胶和黄原胶的组成立体化学结构，并揭示了霜葡萄多糖中阿拉伯糖残基的未知构型。这表明该技术具有较强的稳健性和普遍适用性，可用于分析复杂的糖类结构。

该方法的实验步骤还包括样品的制备和反应条件的优化。研究人员首先将待测单糖称量到反应管中，然后加入相应的试剂。在反应过程中，研究人员通过严格控制pH值、试剂质量、浓度、反应时间和温度，确保反应条件的一致性。通过这些优化，研究人员能够更准确地记录硫唑啉衍生物和原始单糖的NMR数据，并据此确定其绝对构型。此外，该方法的简便性使其在实际应用中更加实用，特别是在处理来自寡糖和多糖酸水解的复杂混合物时。

该方法的实验结果显示，其在实际应用中具有较高的准确性和可靠性。研究人员对22种不同的单糖进行了实验，包括中性醛己糖、醛戊糖、糖醛酸、6-脱氧糖、氨基糖和6-磷酸糖。其中包括六种单糖的D/L对映体对，如岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖。实验结果表明，该方法能够有效地确定这些单糖的绝对构型，并且适用于复杂多糖的分析。例如，该方法被用于确认结冷胶和黄原胶的组成立体化学结构，并揭示了霜葡萄多糖中阿拉伯糖残基的未知构型。这表明该技术具有较强的稳健性和普遍适用性，可用于分析复杂的糖类结构。

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该方法的实验结果显示，其在实际应用中具有较高的准确性和可靠性。研究人员对22种不同的单糖进行了实验，包括中性醛己糖、醛戊糖、糖醛酸、6-脱氧糖、氨基糖和6-磷酸糖。其中包括六种单糖的D/L对映体对，如岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖。实验结果表明，该方法能够有效地确定这些单糖的绝对构型，并且适用于复杂多糖的分析。例如，该方法被用于确认结冷胶和黄原胶的组成立体化学结构，并揭示了霜葡萄多糖中阿拉伯糖残基的未知构型。这表明该技术具有较强的稳健性和普遍适用性，可用于分析复杂的糖类结构。

在实验过程中，研究人员还考虑了各种可能的干扰因素。例如，残留重水（HDO）通常会出现在H-1信号的区域，这可能会进一步影响数据的解释。为了克服这一问题，研究人员使用重水作为反应溶剂，从而减少了残留重水对NMR信号的干扰。此外，该方法还优化了反应条件，包括pH值、试剂质量、浓度、反应时间和温度，以确保反应条件的一致性。通过这些优化，研究人员能够更准确地记录硫唑啉衍生物和原始单糖的NMR数据，并据此确定其绝对构型。此外，该方法的简便性使其在实际应用中更加实用，特别是在处理来自寡糖和多糖酸水解的复杂混合物时。

该方法的实验结果显示，其在实际应用中具有较高的准确性和可靠性。研究人员对22种不同的单糖进行了实验，包括中性醛己糖、醛戊糖、糖醛酸、6-脱氧糖、氨基糖和6-磷酸糖。其中包括六种单糖的D/L对映体对，如岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖。实验结果表明，该方法能够有效地确定这些单糖的绝对构型，并且适用于复杂多糖的分析。例如，该方法被用于确认结冷胶和黄原胶的组成立体化学结构，并揭示了霜葡萄多糖中阿拉伯糖残基的未知构型。这表明该技术具有较强的稳健性和普遍适用性，可用于分析复杂的糖类结构。

在实验过程中，研究人员还考虑了各种可能的干扰因素。例如，残留重水（HDO）通常会出现在H-1信号的区域，这可能会进一步影响数据的解释。为了克服这一问题，研究人员使用重水作为反应溶剂，从而减少了残留重水对NMR信号的干扰。此外，该方法还优化了反应条件，包括pH值、试剂质量、浓度、反应时间和温度，以确保反应条件的一致性。通过这些优化，研究人员能够更准确地记录硫唑啉衍生物和原始单糖的NMR数据，并据此确定其绝对构型。此外，该方法的简便性使其在实际应用中更加实用，特别是在处理来自寡糖和多糖酸水解的复杂混合物时。

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在实验过程中，研究人员还考虑了各种可能的干扰因素。例如，残留重水（HDO）通常会出现在H-1信号的区域，这可能会进一步影响数据的解释。为了克服这一问题，研究人员使用重水作为反应溶剂，从而减少了残留重水对NMR信号的干扰。此外，该方法还优化了反应条件，包括pH值、试剂质量、浓度、反应时间和温度，以确保反应条件的一致性。通过这些优化，研究人员能够更准确地记录硫唑啉衍生物和原始单糖的NMR数据，并据此确定其绝对构型。此外，该方法的简便性使其在实际应用中更加实用，特别是在处理来自寡糖和多糖酸水解的复杂混合物时。

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