基于DART离子源原位甲基化策略的寡糖异构体快速鉴别与定量分析新方法

本研究针对寡糖结构复杂性导致的异构体鉴别难题，开发了一种基于实时直接分析质谱（DART-MS）的原位甲基化新技术。研究人员通过四甲基氢氧化铵（TMAH）试剂在DART离子源中实现寡糖的瞬时在线甲基化，利用甲基化产物在串联质谱（MS/MS）中产生的特征碎片离子，成功区分了聚合度2-8的寡糖及其立体异构体，实现了复杂样品中三糖和五糖异构体的直接定性与定量分析。该方法无需色谱分离，为糖类结构解析提供了高效新平台。

　　

在糖科学领域，寡糖作为具有益生元、免疫调节和抗菌活性的碳水化合物聚合物，其生物功能与营养特性深受分子结构的精细调控。然而，由于单体立体化学、糖苷键位置和分支模式的多样性，寡糖存在广泛的结构异构现象，这些异构体虽具有相同的分子式，却可能表现出截然不同的生物活性。传统的质谱分析方法难以直接区分这些结构高度相似的异构体，通常需要依赖耗时的色谱分离技术（如GC、LC、CE或IMS）与质谱联用，不仅过程繁琐，且对仪器设备和操作条件要求极高。尽管衍生化策略可通过放大结构差异来增强鉴别能力，但现有的离线衍生方法存在步骤繁琐、适用范围有限等问题。因此，开发一种简单、快速、无需预分离的寡糖异构体直接分析技术成为迫切需求。

本研究发表于《Carbohydrate Polymers》，针对上述挑战，研究团队创新性地将四甲基氢氧化铵（TMAH）试剂与实时直接分析（DART）离子源相结合，建立了寡糖原位在线甲基化新方法。该方法利用DART源产生的高能激发态氦气粒子，促使样品与TMAH混合物发生瞬时甲基化反应，并通过彭宁（Penning）过程实现同步离子化。甲基化后的寡糖分子产生包括部分甲基化、完全甲基化、过甲基化、氧加成产物以及甲基化糖片段在内的多种特征离子，这些离子在串联质谱中展现出独特的裂解模式，从而为异构体鉴别提供了丰富的结构信息。

关键技术方法包括：使用DART-SVP离子源与Orbitrap Fusion Lumos质谱仪联用，在正离子模式下进行分析；采用碰撞诱导解离（CID）进行MS/MS实验；以sinensetin作为内标进行定量分析；实际样品（洋葱、猕猴桃、葡萄和橙汁）经研磨、离心和膜过滤后与TMAH混合直接进样。

研究结果部分显示：

3.1. 甲基化反应特性与机理

研究发现，不同聚合度（n=2-8）的寡糖在DART离子源中与TMAH发生瞬时甲基化反应，生成多种甲基化产物。反应在150-250°C即可启动，远低于传统热解甲基化所需温度（≥550°C）。氦气作为工作气体时反应效率高于氮气，因其具有更高的电离能。甲基化过程可能涉及自由基反应机制，由激发态氦气引发TMAH产生·CH₃自由基攻击糖分子羟基，同时高能粒子还可生成活性氧物种（O^*）导致氧加合物的形成。

3.2. 三糖异构体的直接鉴别

研究成功区分了11种三糖异构体（包括5种非还原性和6种还原性三糖）。非还原性三糖（如1-酮糖、松三糖、艾鲁糖、龙胆三糖和棉子糖）虽在全扫描谱图中信号相似，但其完全甲基化产物（m/z 718.42）的MS/MS谱图显示出独特的碎片离子和离子比例特征。还原性三糖（如异麦芽三糖、麦芽三糖、纤维三糖等）则产生更丰富的甲基化片段，通过选择m/z 704.41或718.42作为前体离子进行MS/MS分析，可获得每个异构体的诊断性离子，从而建立特异性识别条形码。

3.3. 五糖异构体的区分

研究进一步验证了该方法对五糖异构体（纤维五糖、麦芽五糖、异麦芽五糖和1F-果呋喃糖基尼斯特糖）的鉴别能力。虽然某些异构体（如纤维五糖和麦芽五糖）在全扫描谱图中信号相似，但通过分析其完全甲基化产物（m/z 1126.62）或甲基化二糖片段（m/z 514.32）的MS/MS谱图，仍可找到特征性碎片离子实现区分。

3.4. 实际样品定量分析

方法成功应用于食品样品中三糖异构体的定性与定量分析。通过内标法（sinensetin）建立了11种三糖异构体的定量曲线，线性范围0.1-200 μg mL^?1，线性良好（R² = 0.9791-0.9989），检测限（LOD）为3-220 ng mL^?1，定量限（LOQ）为13-740 ng mL^?1，日内和日间精密度RSD普遍低于10%。在洋葱、猕猴桃、葡萄汁和橙汁中成功鉴定出龙胆三糖、甘露三糖、层析三糖、纤维三糖和麦芽三糖等多种异构体，并进行了含量测定。

研究结论表明，DART离子源原位甲基化方法为寡糖结构解析提供了一种强大工具。该方法能够在秒级时间内实现寡糖的在线衍生化和离子化，通过MS和MS/MS分析产生丰富的结构信息，直接区分具有细微立体化学差异的异构体。无需色谱分离的特性使其特别适用于高通量筛选和复杂样品分析。该技术对糖科学、食品分析、生物医学等领域具有重要价值，为理解糖类结构与功能关系提供了新的技术支撑。未来研究可致力于构建更全面的糖类甲基化质谱数据库，并探索该方法在含氨基糖、糖醛酸等复杂糖类分析中的应用潜力。