基于实时直接分析离子源的在线甲基化策略实现寡糖异构体的串联质谱精准鉴别

本研究针对寡糖结构复杂性导致的异构体鉴别难题，开发了一种基于实时直接分析离子源（DART）的原位在线甲基化方法。研究人员通过四甲基氢氧化铵（TMAH）试剂在DART源内实现寡糖的瞬时甲基化衍生化，结合高分辨质谱（MS）和串联质谱（MS/MS）技术，成功实现了三糖和五糖异构体的直接鉴别与定量分析。该方法无需色谱分离，显著简化了工作流程，为复杂糖类物质的结构解析提供了新技术平台。

　　

寡糖作为具有益生元、免疫调节和抗菌活性的碳水化合物聚合物，其生物功能高度依赖于复杂的结构特征。然而，由于单体立体化学、糖苷键位置和分支模式的差异，寡糖存在广泛的结构异构现象，这些异构体虽具有相同的分子式，却可能表现出显著不同的生物活性。传统上，寡糖结构的表征主要依赖分离技术与串联质谱（MS/MS）相结合的平台，包括气相色谱（GC）、液相色谱（LC）、毛细管电泳（CE）和离子迁移谱（IMS）等。这些方法基于异构体在物理化学性质上的差异进行分离，但对于结构差异细微的寡糖异构体，其性质往往非常相似，需要开发特殊色谱柱和严格控制的程序，过程困难、耗时且难以重现。尽管CE-MS和IMS在碳水化合物异构体区分方面显示出潜力，但它们分辨率有限、成本高，且先进的商业仪器并不广泛可用。更为重要的是，如果不使用前端分离技术直接分析，结构异构体在准确质量中具有相同的m/z值，并且在MS/MS中产生相似的裂解模式，使得直接鉴定极具挑战性。

为了解决这一难题，研究人员探索了衍生化策略，旨在放大异构体之间的结构差异。研究表明，异构体的衍生化可以放大结构差异，并且衍生化的糖分子在串联质谱中能够产生特征性的产物离子。此外，碳水化合物的衍生化还可以提高其电离效率、稳定性和检测灵敏度。然而，大多数衍生化方法是在溶液中进行离线反应，涉及多个反应步骤和冗长的程序，包括使用1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮、1-(4-羧基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮和二甲基亚砜等进行甲基化。而且，一些衍生化方法仅适用于特定类型的碳水化合物，并且大多数只能用于区分特定类型的少量糖异构体。迄今为止，利用衍生化反应区分糖异构体，尤其是寡糖异构体的应用仍然有限，其用于复杂样品的分析能力有待研究。因此，迫切需要一种无需复杂离线预处理的简单快速方法。

在此背景下，本研究开发了一种强大的即时原位甲基化方法，在一种称为实时直接分析（DART）的常压离子源中，使用四甲基氢氧化铵（TMAH）对寡糖进行衍生化。当样品和TMAH混合物被DART源产生的激发态氦气轰击时，反应瞬间发生，甲基化物种通过彭宁（Penning）过程同时被电离。质谱（MS）分析显示了部分甲基化、完全甲基化和过甲基化产物的形成，以及甲基化糖片段。由于完全或部分甲基化后异构体结构差异的增强，可以产生独特的裂解模式。通过使用准确质量和串联质谱（MS/MS），研究人员证明具有细微结构差异的三糖和五糖异构体产生了显著的特征性碎片离子。对混合物中的异构糖进行了定性鉴定，并对实际样品中的三糖异构体进行了定量分析。该方法能够直接表征寡糖的不同聚合度、立体化学和其他异构差异，与当前使用的工作流程相比显著简化，并省去了耗时的色谱分离步骤。

本研究主要采用了实时直接分析质谱（DART-MS）技术，结合四甲基氢氧化铵（TMAH）在线甲基化衍生化反应。样品制备包括将寡糖标准品或真实样品（如洋葱、猕猴桃、葡萄和橙汁，经研磨、离心和过滤处理）与TMAH溶液混合。使用高分辨率Orbitrap Fusion Lumos质谱仪，通过DART-SVP离子源在正离子模式下进行分析，采用碰撞诱导解离（CID）进行MS/MS实验。数据分析依赖于高分辨率质谱数据，通过特征碎片离子和离子比率对异构体进行鉴别和定量，并采用sinensetin作为内标物进行定量计算。

3.1. 甲基化在DART离子源中的寡糖甲基化

研究首先对未衍生的不同寡糖进行DART-MS分析，发现其主要产生m/z 300以下的自热解碎片离子，如m/z 69.03, 85.03, 97.03, 127.04, 145.05, 180.09，这些离子是己糖的自热解碎片，对于不同的碳水化合物化合物是相似的。而当与TMAH溶液混合后，DART-MS谱图完全不同，产生了多种甲基化产物。准确质量分析揭示了五种类型的甲基化产物，包括部分甲基化、完全甲基化（全甲基化）、过甲基化、加氧产物和甲基化糖片段。完全甲基化是指寡糖分子中所有羟基都被甲基取代的状态。过甲基化是指向寡糖分子中引入了过量甲基基团。质子化的三甲胺离子是甲基化碳水化合物主要的电离形式。例如，二糖的完全甲基化离子为[C₁₁H₂₂O₁₁ + 8CH₂ + N(CH₃)₃H⁺] m/z 514.32，三糖为[C₁₈H₃₂O₁₆ + 11CH₂ + N(CH₃)₃H⁺] m/z 718.42。部分甲基化产物也被检测到。此外，还观察到甲基化片段，它们可能来源于DART离子源中碳水化合物的自热解产物的甲基化，或甲基化前体离子的源内裂解。对于环糊精系列（n=6至8），主要产生全甲基化和过甲基化产物，没有明显的碎片，这可能归因于其相对稳定的环状结构。研究表明，使用氦气和工作气体比氮气能产生更高的信号，并且甲基化反应所需的最低和最佳温度随着糖分子大小的增加而逐渐升高，但远低于传统GC中使用TMAH的热解甲基化所需温度（≥550°C）。甲基化效率超过95%，且不同结构的产率相似。结果表明，不同聚合度的寡糖在DART离子源中与TMAH发生快速、直接的甲基化，无需离线预处理，其机制可能涉及激发态氦气和彭宁电离引发的自由基形成和反应过程。

3.2. 三糖异构体的直接表征

研究考察了具有不同单体组成、连接键和异头构型的11种三糖结构异构体（5种非还原性三糖和6种还原性三糖）。所有非还原性三糖产生了相同的全扫描MS谱图，包括m/z 718.42, 704.41和734.42，这可能是因为非还原性三糖缺乏半缩醛羟基，结构相对稳定。然而，以m/z 718.42（完全甲基化信号）为前体离子进行MS/MS分析时，获得了独特的裂解模式，并注释了特征离子。例如，1-酮蔗糖[Glc-α-(1→2)-Fru-β-(1→2)-Fru]产生了一系列丰富的CH₃OH中性丢失和H₂O丢失的产物离子，并发现了m/z 481.24和499.25的特征离子。松三糖[Glc-α-(1→2)-Fru-β-(3→1)-Glc]产生了一些碎片离子，其m/z 482.30与m/z 276.18的比率（约5:1）是其特征性的。棉子糖[Gal-α-(1→6)-Glc-α-(1→2)-Fru]则发现了m/z 514.32的特征信号，这是棉子糖失去一个单糖单元后的甲基化产物[Y₂ + CH₂ + N(CH₃)₃H⁺]。还原性三糖结构异构体（包括异麦芽三糖、麦芽三糖、纤维三糖、海带三糖、潘糖和甘露三糖）的结构高度相似，仅连接键和/或异头构型不同。DART-MS分析显示，与非还原性三糖不同，还原性三糖在全MS扫描中观察到多个甲基化产物，包括三糖及其片段的甲基化产物（如m/z 748.43, 718.42, 704.41, 660.38, 614.34）、二聚体及其片段的甲基化离子（如m/z 544.33, 514.32, 500.31, 410.24）以及甲基化单体的质谱峰（m/z 310.22）。这表明对于还原性三糖，在DART离子源内广泛发生了热解裂解，包括跨环断裂和糖苷键断裂，这些片段也发生了甲基化。虽然不同的还原性三糖结构异构体有一些共同的离子，但MS图谱及其相对强度是独特的。以前体离子m/z 704.41进行MS/MS分析，每个异构体都产生了独特的产物离子。例如，异麦芽三糖的特征碎片为m/z 441.23，麦芽三糖为m/z 377.18和482.30，纤维三糖为m/z 373.19，海带三糖为m/z 359.17和468.28。基于获得的数据，研究人员开发了一个工作流程来从混合物中鉴定异构三糖，利用特征产物离子和离子比率作为诊断离子来识别特定的三糖结构异构体，并为不同的异构体构建了独特的条形码标识。该方法成功应用于五非还原性三糖和六还原性三糖异构体混合物的鉴定，表明甲基化反应和电离行为在混合物或纯形式下都不发生变化。

3.3. 五糖结构异构体的区分

研究考察了一组五糖结构异构体（纤维五糖、麦芽五糖、异麦芽五糖、1F-呋喃果糖基尼斯特糖），以验证甲基化反应结合串联质谱是否能够区分更高聚合度的寡糖。DART-MS分析显示，仅异头构型不同的纤维五糖和麦芽五糖产生了相似的MS信号，包括m/z 1126.62, 1022.53, 818.44, 614.32, 410.24和310.11，这些信号可能来源于连续丢失甲基化己糖（C₆H₁₀O₅ + 3CH₂）单元。1F-呋喃果糖基尼斯特糖产生了甲基化离子m/z 1126.62, 922.53, 718.42和514.32，其差异也在于一系列甲基化己糖，表明糖苷键断裂广泛发生。而异麦芽五糖的MS图谱主要是纤维五糖和1F-呋喃果糖基尼斯特糖的组合。以m/z 1126.62为前体离子进行MS/MS分析，纤维五糖的裂解不太成功，仅产生一个次要的产物离子m/z 359.17；麦芽五糖产生了m/z 892.50和1108.57的特征离子；异麦芽五糖产生了多个碎片，其中m/z 862.46是一个特征离子；1F-呋喃果糖基尼斯特糖产生了丰富的碎片离子，其中m/z 327.14, 405.21, 531.24和908.49可作为其标识离子。混合物分析成功识别了其中三种五糖异构体（不包括纤维五糖）。然而，对全质谱扫描中获得的m/z 514.32 [C₁₂H₂₂O₁₁ + 8CH₂ + N(CH₃)₃H⁺]进行MS/MS分析，产生了不同的谱图和特征离子，这可用于将纤维五糖与其他五糖异构体区分开来。结果表明，DART离子源的甲基化反应对于表征五糖结构异构体同样是有效和高效的，这表明该过程很可能在气相中发生，其中碳水化合物的立体化学得以保留、放大和区分。

3.4. 真实样品中三糖的定量分析

为了验证常压电离串联质谱的原位甲基化方法，研究人员对不同浓度的三糖异构体进行了研究。采用无羟基黄酮类化合物sinensetin（C₂₀H₂₀O₇, m/z 373.13）作为内标（IS），将其添加到不同溶液中。所有11种三糖异构体在0.1至200 μg mL^?1的浓度范围内均获得了良好的线性（R² = 0.9791至0.9989）。检测限（LOD）范围为3至220 ng mL^?1，定量限（LOQ）范围为13至740 ng mL^?1。重现性的相对标准偏差（RSD）值通常低于10%。该方法进一步应用于真实样品中三糖异构体的定性和定量分析。将食品样品（洋葱、猕猴桃、葡萄和橙汁）的液体溶液与TMAH试剂混合，并加入已知量的sinensetin（IS），无需其他预处理即可直接进行DART-MS和MS/MS分析。在其全质谱扫描中检测到m/z 704.41和718.42的显著质谱峰，并对两者都进行了CID实验。根据鉴定程序和诊断离子，在不同的真实样品中鉴定出了不同的三糖结构异构体。定量计算采用已识别三糖的特征碎片离子峰面积（A_S′）与内标选定产物离子峰面积（A_IS′）的比值，通过响应因子F进行计算。定量结果显示，洋葱和橙汁含有相同的三糖异构体（龙胆三糖、甘露三糖和麦芽三糖），但洋葱中甘露三糖的含量高于橙汁。猕猴桃中发现的三糖种类最多，包括龙胆三糖、甘露三糖、海带三糖、纤维三糖和麦芽三糖，其中海带三糖最丰富。葡萄汁含有除麦芽三糖外的所有图例中的三糖，且纤维三糖含量最高。在所研究的食品样品中，还原糖是三糖的主要形式，龙胆三糖存在于所有样品中，但含量各异。

本研究报道了一种使用常压离子源对由己糖和戊糖组成的寡糖进行通用的原位甲基化方法。各种寡糖（n=2至8）在DART离子源产生的热气流（150至250°C）存在下，与TMAH试剂发生瞬时反应，该气流包含激发态亚稳态物种。结果表明，DART离子源同时作为甲基化反应室和电离源，该过程主要通过能量转移、自由基形成和链式反应在气相中进行。当与MS和MS/MS分析相结合时，该方法产生独特的甲基化前体和产物离子，从而能够区分糖结构异构体，包括三糖和五糖。碳水化合物异构体表现出特征性的MS模式，具有独特的诊断性产物离子，允许从复杂混合物中直接鉴定特定异构体。该方法展示了识别碳水化合物立体化学特征的潜力，并在不同类别的寡糖中表现出良好的选择性。此外，所开发的工作流程已成功应用于真实样品中三糖异构体的定性和定量分析。这项工作为表征复杂碳水化合物化合物的结构异质性建立了一种强大的方法，在速度、简单性和稳健性方面具有显著优势。该技术需要最少的样品制备，并省去了色谱分离的需要。