猪源caspase-7单克隆抗体的制备与功能鉴定及其在程序性细胞死亡研究中的创新应用

本研究成功制备了针对猪源caspase-7（pcaspase-7）的特异性单克隆抗体（mAbs），填补了猪程序性细胞死亡（PCD）研究工具空白。抗体可特异性识别pcaspase-7并区分其他caspase家族成员，适用于Western blot、免疫荧光及免疫沉淀实验，首次揭示pcaspase-7可切割猪GSDMD（pGSDMD），为猪疾病模型与PCD机制研究提供关键试剂。

　　

Section snippets

Plasmids and cells

本研究使用的质粒列于表1。用于基因克隆、重组质粒构建和突变生成的引物见补充表S1。

Sp2/0和杂交瘤细胞使用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基培养。人胚胎肾细胞（HEK-293）、猪肾细胞（PK-15）、猪肠上皮细胞系J2（IPEC-J2）、叙利亚幼仓鼠肾细胞（BHK-21）、牛支气管上皮细胞（MDBK）和鸡肝癌细胞（LMH）均使用DMEM培养基（含10% FBS）培养。

Preparation of rpcaspase-7 C186A protein

通过扩增的pcaspase-7基因编码的蛋白一级结构如图1A所示。我们最初尝试在大肠杆菌（E. coli）中表达野生型pcaspase-7，但该蛋白在表达过程中自发激活，导致重组蛋白产量极低。因此，我们构建了名为pET-30a(+)-pcaspase-7 C186A的质粒，其编码的第186位半胱氨酸（C）被丙氨酸（A）取代的pcaspase-7突变体（图1B）。

Discussion

现有关于pcaspase-7的研究通常使用人源caspase-7特异性抗体进行检测，但采用pcaspase-7特异性抗体将显著增强结果的可靠性。单克隆抗体（mAbs）在特异性靶标检测中具有显著优势。鉴于半胱天冬酶（caspases）存在结构相似性，针对特定caspase的mAbs成为其检测与区分的重要工具。本研究制备的mAbs能够特异性识别pcaspase-7，且不与pcaspase-1、-3、-8、-13及其他物种caspase-7发生交叉反应，为猪疾病模型中pcaspase-7的功能研究提供了精准探针。

Conclusion

综上所述，本研究成功制备了可特异性识别pcaspase-7蛋白的单克隆抗体，并明确了其靶向抗原表位。同时，测定了抗体可变区的一级结构。所制备的mAbs可作为一抗用于Western blot和免疫荧光（IFA）实验，并可通过免疫沉淀（IP）纯化pcaspase-7。这些抗体将成为未来pcaspase-7相关研究的重要工具。