两种鲫鱼种群应对碱度胁迫的生理与分子机制适应性分化研究

本研究针对全球盐碱水域扩张对水生生物造成的威胁，聚焦淡水与碱性水鲫鱼种群对碱度胁迫的响应差异。通过整合生理指标测定、鳃组织转录组学和血清代谢组学分析，揭示了DL种群（碱性水适应）在高碱度条件下通过增强尿素循环、抑制氨基酸氧化及调节能量代谢通路（如ALT介导的转氨作用）实现更优的氨解毒和能量稳态调控，为盐碱水养殖品种选育提供了关键分子靶点和理论依据。

　　

随着全球气候变化和人类活动加剧，盐碱水体的扩张正成为威胁水生生物生存与繁殖的重要环境问题。高碱度（尤其是碳酸盐碱度）作为主要胁迫因子，可引起鱼类多器官损伤、呼吸障碍、离子酸碱调节失衡、氨中毒及代谢性碱中毒等一系列生理紊乱，严重制约渔业可持续发展。中国作为全球第三大盐碱地分布国，拥有约4600万公顷的低洼盐碱水域，探究鱼类对碱性环境的适应机制对评估其适应潜力、指导分子育种及推动可持续盐碱水养殖至关重要。

氨中毒被广泛认为是盐碱环境中鱼类死亡的主要原因，耐碱鱼类进化出独特的解毒策略以应对碱度胁迫下体内氨水平的升高，包括逆血液-水扩散梯度的主动氨跨膜转运，以及将氨转化为无毒的代谢产物如尿素、谷氨酰胺和其他氨基酸。此外，水生生物在碱度胁迫下会增加能量代谢以维持生理过程的稳态，如氨氮排泄。鳃作为参与氨氮排泄、气体交换和离子运输的重要组织，已成为碱度响应研究的目标组织，同时也是接收应激信号并在分子尺度启动级联效应的第一线组织。产生的生物分子和代谢物进入血液循环系统，诱导全身性代谢响应。

鲫鱼（Carassius auratus）作为中国主要淡水养殖物种，年产量达284万吨，在所有养殖淡水鱼中排名第五，展现出显著的生态可塑性，既能栖息于淡水河流，也能在盐碱生态系统中繁衍生息。它已成为达里湖的优势商业物种，适应了碳酸盐碱度53.57 mmol/L、pH 9.0的极端条件，是研究碱度耐受机制的优秀物种。

本研究选取了两种生态分化的种群：来自淡水环境的萍乡红鲫（PX）和来自碱性湖泊（达里湖，碳酸盐碱度：53.57 mM）的达里湖鲫鱼（DL），通过设置淡水（0 mmol/L NaHCO₃）、低（10 mmol/L）、中（30 mmol/L）和高（50 mmol/L）碱度条件，进行为期7天的碱度胁迫实验，系统比较了它们的生理响应、鳃转录组和血清代谢组差异。

研究主要采用了以下关键技术方法：使用自动化血液分析仪和商业试剂盒测定血氨、尿素氮（BUN）、血红蛋白（Hgb）浓度和红细胞（Rbc）计数等生理指标；通过Illumina NovaSeq平台进行鳃组织RNA测序（RNA-seq），采用HISAT2进行序列比对，DESeq2进行差异表达基因（DEGs）分析；基于LC-MS技术进行血清非靶向代谢组学分析，借助OPLS-DA模型鉴定差异积累代谢物（DAMs）；利用SnpEff和PLINK进行SNP注释和过滤，MEGA-X构建系统发育树；通过KEGG数据库对DEGs和DAMs集进行功能富集分析，揭示显著通路。

3.1. 生理响应碱度变化

两个种群（PX和DL）在7天碱度胁迫下表现出不同的生理响应。血氨和BUN水平在低、中碱度条件下（A10和A30）较淡水条件（A0）均略有升高，但仅PX种群在高碱度条件（A50）下这些参数显著增加。在氧气运输能力方面，Hgb浓度和Rbc计数在高碱度（A50）下均显著增加，但在低、中碱度条件（A10和A30）下保持不变。值得注意的是，Rbc计数在淡水条件下PX和DL种群间存在显著差异，PX种群在所有碱度条件下均保持较高计数。这些结果表明，DL种群在高碱度胁迫下表现出更优的耐受性。

3.2. 转录组学分析概要

RNA-seq分析在所有样本中共生成158.87 Gb原始数据和155 Gb清洁数据。与淡水对照（DL_A0）相比，DL种群在低碱度暴露（DL_A10）诱导255个上调和83个下调基因，中碱度暴露（DL_A30）导致1442个上调和479个下调基因，高碱度暴露（DL_A50）诱导688个上调和312个下调基因。PX种群在相应处理下差异基因数量较少。跨种群比较揭示了大量种群 divergent 基因。DL种群在所有处理中均比PX种群拥有更多DEGs。

3.3. DEG sets的功能富集分析

KEGG富集分析发现，DL种群的558个碱度响应DEGs富集于32条通路（P < 0.05），独特富集于ECM-受体相互作用、p53信号通路、亚油酸代谢、铁死亡和apelin信号通路。PX种群的261个碱度响应DEGs富集于25条通路，独特富集于C型凝集素受体信号通路、坏死性凋亡、乙醛酸和二羧酸代谢以及RIG-I样受体信号通路。种群 divergent DEGs富集于42条显著KEGG通路。

值得注意的是，14条KEGG通路是共同富集的，包括脂肪代谢（脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸生物合成、脂肪酸延长和花生四烯酸代谢）、氨基酸代谢（氨基酸生物合成和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢）、碳水化合物代谢（氨基糖和核苷酸糖代谢、核苷酸糖生物合成）、氮代谢和PPAR信号通路。这些共享通路中的基因计数在DL种群中高于PX种群。

3.4. 代谢组学分析概要

在所有血清样本中共鉴定出1120种代谢物。主成分分析（PCA）得分图显示QC样本聚集在小区域内，表明仪器具有高稳定性和重现性。OPLS-DA评分图显示组间分离明显。在所有 pairwise 比较中共鉴定出977个DAMs。代谢物类别组成分析显示，主要类别是氨基酸及其衍生物（24.77%），其次是有机酸及其衍生物。DL种群在所有处理中的DAMs数量始终多于PX种群。

3.5. DAM sets的功能富集分析

DL种群中454个碱度响应DAMs富集于9条KEGG通路，PX种群中319个碱度响应DAMs富集于5条通路，种群 divergent DAMs富集于2条KEGG通路。值得注意的是，两个种群中64%的碱度响应代谢物均富集于代谢途径（dre01100；DL P < 0.01，PX P < 0.05），这是高度综合的 pathway maps，涵盖了生物体内几乎所有的基本代谢过程。戊糖和葡萄糖醛酸相互转化也在两个种群中富集。氨基酸生物合成和D-氨基酸代谢是DL特异的KEGG通路。

3.6. 基于SNP、基因表达和代谢物水平的生物样本聚类

系统发育分析（基于SNPs）显示，所有样本聚集成两个不同的分支，分别对应DL和PX种群，与碱度暴露无关。基于FPKM的PCA显示，主成分1（PC1）（25.45%）区分了两个种群间的基因表达模式，而主成分2（PC2）（9.27%）按碱度处理分离了样本。基于代谢物的PCA显示了DL和PX种群沿成分1（12.4%）的清晰分离。每个种群内的进一步分析表明，碱度暴露是分化的驱动因素。

3.7. 鳃转录组学与血清代谢组学的整合分析

基于碱度响应和种群 divergent 基因，研究聚焦于几个可能响应碱度胁迫的显著共同富集代谢通路。这些通路以三羧酸（TCA）和尿素循环为中心，包括脂代谢相关通路、氨基糖和核苷酸糖代谢、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代谢、氮代谢和精氨酸生物合成，它们在氨解毒和能量代谢中起重要作用。这些代谢通路中的血清代谢物表现出显著变化，可能与鳃转录组学存在潜在的生理联系。

一些关键代谢物的血清水平在不同组间也表现出显著变化。琥珀酸和α-酮戊二酸（TCA循环中间体）在两种种群中响应碱度胁迫均显著下降，DL种群中草酰乙酸含量积累。果糖（Fru）含量在高碱度条件下（DL_A50和PX_A50）较淡水条件（DL_A0和PX_A0）下降。DL种群中谷氨酸含量在碱度胁迫下（A10、A30和A50）明显下降，但PX种群中未观察到变化。相反，两种种群中谷氨酰胺含量在中度碱度胁迫（A30）下明显积累。此外，还观察到种群间差异：DL种群谷氨酰胺含量低于PX种群，但谷氨酸含量更高。两种种群中丙酮酸水平在碱度胁迫下下降。DL种群中天冬氨酸含量在碱度胁迫下下降，而PX种群中未观察到变化。精氨酸在PX种群中积累更高，在高碱度条件（A50）下DL种群中明显下降。相反，两种种群中鸟氨酸含量在碱度条件下增加。

在这些通路的关键基因中观察到显著的差异转录模式。十五个关键DEGs参与能量稳态和氨解毒。丙氨酸氨基转移酶（ALT）、氨甲酰磷酸合成酶1（CPS1）和L-氨基酸氧化酶（LAAO）在DL种群碱度条件下下调，但PX种群中无显著变化。精氨琥珀酸合成酶1（ASS1）和谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1（GFPT1a和GFPT1b）在DL种群中基线表达水平较高，并在碱度条件下下调。碳酸酐酶2（CA2a和CA2b）、葡萄糖胺磷酸N-乙酰转移酶1（GNPNAT1a和GNPNAT1b）和葡萄糖转运蛋白类型1（GLUT1）下调，而磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PCK2）和ALT在高碱度条件（A50）下于两种种群中上调。硬脂酰-CoA去饱和酶（SCD2和SCDb2）在两种种群中显著上调，而SCD1和SCDb1仅在DL种群中上调。种群特异性响应包括PX种群中脂肪酸合酶（FASN1和FASN2）上调和DL种群中谷氨酰胺酶（GLS）下调。谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脱氢酶（GDH）和磷酸甘油酸变位酶（PGAM）的表达在不同碱度条件下相对稳定。

本研究通过对两种生态分化的鲫鱼种群进行为期7天的碱度胁迫实验，揭示了它们在生理、分子和代谢水平上的适应性分化。两种种群对低、中碱度均表现出高耐受性，但碱性水种群（DL）对高碱度胁迫的耐受性高于淡水种群（PX）。研究构建了一个基于鳃转录组最强证据的整合调控网络，并利用血清代谢组提供了支持性的系统背景。

通过结果推测，基因（CPS1、GLS、LAAO和ALT）和代谢物（谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸）对碱度的差异响应是DL和PX种群间碱度适应性分化的驱动因素。氨基糖和核苷酸糖代谢、脂代谢、氮代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢在维持碱度环境下的氨解毒和能量稳态中起至关重要的作用，ALT可能作为平衡能量供应和氨解毒的关键调节因子。

本研究为鱼类碱度耐受机制提供了新见解，为评估鱼类在盐碱生态系统中的适应潜力和促进可持续水产养殖发展提供了理论基础。论文发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》期刊上。