整合转录组与代谢组学解析三叶木通果实成熟期功能成分生物合成路径的动态调控机制

本研究针对三叶木通（Akebia trifoliata）果实成熟机制不明的问题，通过整合转录组与代谢组学技术，系统分析了五个发育阶段的分子调控网络。研究发现NAC、MYB、AP2/ERF等关键转录因子家族及蔗糖 synthase（SUS）、淀粉酶（amylases）和 invertase（INV）等基因的阶段性表达模式，揭示了类黄酮合成早期启动、淀粉降解中期强化、蔗糖积累晚期暴发的代谢通路协同调控机制。最终阶段 invertase 的剧烈诱导导致蔗糖和果糖大量积累，奠定了果实甜味特征。该研究为通过现代育种技术改善三叶木通营养品质和风味性状提供了关键候选基因和代谢标记物。

　　

果实成熟是一个高度协调的复杂过程，涉及生化、生理和分子事件的精密调控，最终将未成熟果实转化为美味且营养丰富的食品。对于三叶木通（Akebia trifoliata）这种具有重要生态和营养价值的果实，其独特的风味、药用价值和潜在健康益处虽被认可，但其成熟过程的分子机制、影响风味和营养成分的因素却缺乏深入研究。这种认知空白限制了果实品质的改进、采收时间的优化以及其商业价值的提升。因此，解析三叶木通果实成熟的转录组和代谢组动态，对于理解其生物化学过程、挖掘其农业和药用潜力至关重要。

为了深入探究这一问题，研究人员在《Food Chemistry: Molecular Sciences》上发表了一项研究，他们收集了三叶木通果实五个发育阶段（FA, FB, FC, FD, FE）的果肉样本，分别对应于盛花后136、148、158、166和174天。研究采用了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）进行广泛的代谢物分析，同时利用Illumina测序平台进行转录组测序。关键生物信息学分析包括使用HISAT2将高质量测序读数比对到三叶木通参考基因组，利用StringTie进行转录本组装，并通过DESeq2进行差异表达基因（DEGs）鉴定。代谢组数据则通过主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等多变量统计分析来识别差异积累代谢物（DAMs）。最后，通过联合分析（conjoint analysis）整合两组学数据，将差异表达的基因和代谢物映射到KEGG通路中，以揭示关键的生物学路径。

研究结果揭示了果实成熟过程中高度动态的分子事件。

3.1. 转录组数据概览

测序产生了高质量的数据，PCA分析显示基因表达沿发育轨迹明显分离。差异表达分析发现，从FA到FE的成熟过程中，共有8553个基因差异表达，表明基因组的大部分被激活或抑制以响应发育信号。

3.2. 差异基因表达的时序动态

鉴定出76个在连续阶段比较（FB vs FA, FC vs FB, FD vs FC, FE vs FD）中重叠的DEGs，它们在整个成熟过程中持续发挥核心调控作用。例如，参与赖氨酸降解的AKT000026在整个过程中持续上调，而编码E3泛素连接酶的AKT000025在后期阶段（FC到FD，FD到FE）上调，表明其在蛋白质降解和细胞结构重塑中的关键作用。热休克蛋白（HSPs）基因在早期高表达，随后下降，反映了从应激响应机制向成熟特异性过程的转变。

3.3. 三叶木通果实成熟过程中淀粉和蔗糖代谢的调控

淀粉和蔗糖代谢基因表现出阶段特异性表达模式。蔗糖合酶（SUS, AKT000057）和β-淀粉酶（AKT000959）在早期（FB）高表达，促进蔗糖裂解和淀粉分解。中后期，葡聚糖内切-1,3-β-葡萄糖苷酶（AKT001060）和内切葡聚糖酶（AKT000133）表达增强。最显著的是，蔗糖 invertase（AKT019260）在后期（FD和FE）被极度诱导（FPKM从22.70增至4154.26），驱动蔗糖水解为葡萄糖和果糖，导致甜味显著增强。α-淀粉酶3（AKT011802）在整个过程中持续高表达，而β-淀粉酶1（AKT006405）则在早期最高并逐渐下降。

3.4. 三叶木通成熟过程中的转录因子动态

在DEGs中鉴定出525个转录因子（TFs），其中165个与果实成熟相关，包括NAC、AP2/ERF、WRKY、MYB等家族。例如，NAC TF AKT000864在后期（FE）表达达到峰值，类似于番茄中SlNAC1和NOR等成熟主调控因子，表明其在促进成熟最终步骤中的关键作用。MYB TF AKT003828在早期（FA）高表达，随后下降，其表达模式与典型的促进花青素合成的MYB（如苹果MdMYB1）相反，暗示它可能是类黄酮途径的转录抑制因子。AP2/ERF TFs（如AKT009029）在早中期高表达，支持其在乙烯信号传导中的作用。

3.5. 调控果实成熟的代谢特征

代谢组学分析显示，萜类（19.73%）和类黄酮（14.89%）是主要的代谢物类别。PCA分析清楚区分了不同发育阶段的代谢特征。差异代谢物分析揭示了代谢物水平的剧烈重构。

3.6. 时序代谢动态

鉴定出50个差异积累代谢物（DAMs）。生物碱L-哌啶酸（L-Pipecolate）在最终成熟阶段FE积累增加，表明其参与防御机制。氨基酸L-苏氨酸（L-Threonine）在早期阶段积累，突出其在蛋白质合成中的重要性。黄烷醇(-)-表儿茶素（(-)-Epicatechin）在早期成熟阶段FB达到峰值，有助于抗氧化能力和颜色发育。后期阶段，蔗糖和果糖等糖代谢物高度积累，是果实变甜的关键。

3.7. 代谢组和转录组的联合分析揭示果实成熟的关键通路

联合分析揭示了阶段特异性的生化遗传转变。早期阶段（FA to FB）富集于类黄酮和苯丙烷生物合成，以提供抗氧化保护。中期阶段（FB to FC）持续强调防御和酚类化合物生产。中后期过渡（FD vs FC）显示茉莉酸（JA）生物合成通路中基因与(-)-茉莉酸水平的强相关性，强调了JA信号在增强防御中的作用。最终阶段（FE vs FD）关注辅因子生物合成的基因-代谢物关系，支持成熟最终阶段的高能量需求。

3.8. 关键代谢和调控通路的 delineation

3.8.1. 类黄酮生物合成通路的动态调控

通路整合显示了一个高度动态的、阶段特异性的调控程序。通路初始步骤在早期（FA to FB）被强烈激活，4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL2）和查尔酮合酶（CHS）等关键基因显著上调，导致柚皮素查尔酮和柚皮素等中央中间体积累增加，进而促使黄烷-3-醇如(-)-表儿茶素和(+)-儿茶素在早中期（FB和FC）激增。随着果实完全成熟，许多核心结构基因的表达减弱，但晚期阶段的特点是通过糖基化对现有类黄酮进行广泛修饰，UDP-糖基转移酶（UGTs）的高表达或特异性诱导驱动了各种花青素糖苷的形成，这些是成熟果实最终紫色的原因。

3.8.2. 激素生物合成和信号通路的动态调控

对主要植物激素的研究揭示了不同激素之间复杂的相互作用，茉莉酸（JA）、生长素和脱落酸（ABA）信号传导显得特别活跃。JA通路在整个成熟过程中呈现动态调控，AOS1和AOC等关键生物合成基因差异表达，与JA前体12-氧代-植物二烯酸（12-oxo-PDA）和JA本身的积累相关，表明JA信号在成熟启动和最终阶段都发挥作用。生长素生物合成通路中，YUC10基因早期（FB vs FA）上调但后期下调，与生长素在早期果实发育中的作用一致。ABA生物合成基因ABA2在中后期被诱导，而乙烯通路基因如ACS3在FD vs FC过渡期活跃，这与它们在促进跃变型果实成熟中的作用一致。

3.8.3. 从淀粉降解到可溶性糖积累的代谢转变

sweetness的发展是果实成熟的关键指标。分析揭示了主要的代谢重编程事件，从早期阶段的淀粉降解转变为最终成熟阶段可溶性糖（尤其是果糖和葡萄糖）的 dramatic 积累。早期果实发育（FA to FC）期间，与淀粉降解相关的基因活跃表达，α-淀粉酶和β-淀粉酶基因上调，将淀粉分解为麦芽低聚糖（MOS）和麦芽糖。蔗糖代谢在整个成熟过程中呈现动态变化，蔗糖磷酸合酶（SPS）等蔗糖合成基因中度表达。最显著的转录事件发生在最终成熟过渡期（FE vs FD），编码 invertases 的基因被剧烈且显著地上调， directly correlated with 果糖和葡萄糖的显著积累，它们是成熟果肉甜味的主要贡献者。

研究结论与讨论部分强调，这项工作为理解三叶木通果实成熟过程提供了一个全面的分子框架。研究揭示了高度协调的时序事件，包括早期类黄酮合成和淀粉降解的启动、中期防御信号和酚类化合物生产的强化，以及晚期 invertase 介导的糖分积累暴发。鉴定出的关键基因、转录因子和代谢通路为未来旨在操纵果实品质性状和延长货架期的研究提供了宝贵靶点。特别值得注意的是，NAC TF AKT000864 的表达模式与跃变型果实成熟主调控因子保守，而 MYB TF AKT003828 的独特表达模式暗示了其作为抑制子的新功能。热休克蛋白（HSPs）的下调标志着从广义应激反应向特定成熟程序的发育转变。这些发现通过多组学整合，与近期对三叶木通果皮开裂机制的研究相互补充，共同揭示了细胞壁降解和苯丙烷代谢的核心作用。未来的研究应侧重于功能基因组学方法，如病毒诱导基因沉默（VIGS）和酵母单杂交（Y1H）试验，以验证这些关键的候选基因及其调控关系，从而将候选基因转化为三叶木通遗传改良的真正靶点。