基于快速构建与筛选系统开发抗SARS-CoV-2和猴痘病毒特异性人源单克隆抗体

本研究针对传统鼠源单抗易引发免疫排斥及人源抗体开发周期长、成本高等问题，建立了一种整合重组抗原制备、多色荧光抗原四聚体标记、记忆B细胞分选、单细胞基因扩增和scFv快速筛选的一体化平台。研究人员成功从疫苗接种者PBMCs中筛选出靶向SARS-CoV-2 N/S1蛋白和MPXV M1R蛋白的高特异性人源单抗，其中抗M1R scFv在体外显著抑制痘病毒复制。该研究为应对新发传染病及肿瘤免疫治疗提供了高效、低成本的抗体开发策略。

　　

在生物医学领域，单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）已成为治疗传染病、癌症和自身免疫疾病的重要武器。然而，抗体药物的开发历程并非一帆风顺——最早使用的鼠源抗体虽在科研和临床中展现出潜力，却存在致命缺陷：它们可能诱发人体产生抗鼠抗体（human anti-mouse antibodies, HAMA），导致疗效下降、检测干扰甚至严重过敏反应。为了解决这些问题，科学家们陆续开发出人鼠嵌合抗体、人源化抗体，直至第四代全人源抗体。全人源抗体完全不含鼠源成分，极大降低了免疫排斥风险，但如何快速、高效地获得这类抗体仍是当前面临的挑战。

传统的抗体开发技术如转基因小鼠、噬菌体展示或单细胞测序，分别存在周期长、成本高、假阳性率高等局限。特别是在应对新发突发传染病时，时间就是生命，亟需一种能在普通实验条件下快速筛选高特异性人源抗体的平台。正是在这一背景下，河南大学研究团队在《Immunobiology》上发表了一项研究，他们建立了一套整合多技术路径的快速抗体构建与筛选系统，并成功应用于抗SARS-CoV-2和猴痘病毒（monkeypox virus, MPXV）抗体的开发。

该研究的关键技术方法主要包括五大环节：首先，采用通用抗原表达载体系统快速制备重组抗原，抗原C端引入Avi标签便于位点特异性生物素化；其次，利用链霉亲和素-荧光染料复合物构建多色抗原四聚体，提高抗原特异性B细胞的筛选效率；第三，从疫苗接种者外周血单核细胞（PBMCs）中通过流式细胞术分选记忆B细胞（CD19⁺CD27⁺IgM^?）；第四，通过单细胞逆转录PCR与巢式PCR扩增抗体可变区基因；最后，将轻重链可变区通过柔性连接肽(GGGS)₃组装成单链抗体（scFv），并在293T细胞中表达，通过ELISA和Western blot进行快速结合特性鉴定。

研究结果部分分为三个主要板块：

第一章“多色抗原四聚体筛选特异性记忆B细胞与单细胞抗体可变区扩增”中，研究人员成功表达了SARS-CoV-2的N蛋白（约50 kDa）和S1蛋白（约80 kDa），并完成生物素化验证。通过多色四聚体标记（APC与APC/Cy7双阳性）策略，从新冠疫苗接种者PBMCs中分选到抗原特异性B细胞，双阳性群体占比仅0.35%，显著降低非特异性背景。通过亚类特异性引物设计提高了重链可变区（V_H）扩增效率，最终获得6对抗N蛋白和4对抗S1蛋白的抗体可变区序列。

在第二章“scFv的构建与快速结合特性鉴定”中，团队构建了含信号肽和3×Flag标签的scFv表达盒，所有scFv均成功表达并分泌。ELISA结果显示，这些scFv均能特异性结合对应抗原，其中SA7（抗S1）和NB1（抗N）抗体对无关蛋白（BSA、VACV A33、MPXV M1R/A29L）均无交叉反应，证实了筛选系统的高特异性。

第三章“抗猴痘病毒M1R蛋白功能性mAb的快速筛选”则将该平台拓展至另一种高风险病原体。研究人员从40年前接种过天花疫苗的志愿者体内分选M1R特异性记忆B细胞，获得8对可变区序列。其中7个scFv成功表达，MB7展示出最高结合活性，且能特异性识别M1R蛋白，而非其他痘病毒抗原或SARS-CoV-2蛋白。通过彗星抑制实验（comet inhibition assay）进一步证明，MB7 scFv可有效抑制痘病毒（VACV）在细胞中的复制与扩散，提示其具有中和活性与保护潜能。

在讨论与结论部分，研究者对比了现有抗体开发技术的优劣：转基因小鼠耗时且对弱免疫原性抗原响应差；噬菌体展示需构建库且亲和力低；单细胞测序成本高、假阳性率高。而本研究建立的系统无需动物免疫，2–3周内即可获得scFv，特别适合新发传染病的快速响应。尽管目前系统仍存在scFv表达量低、缺乏亲和力定量评价等局限，但研究者已规划了后续优化方向，包括改进流式分选策略、改用原核表达系统提升产量、构建全人IgG等。短期内将聚焦于抗MPXV抗体MB7的全长抗体构建与动物模型验证，中长期则计划拓展至肿瘤抗原靶点筛选。

该研究不仅为抗病毒治疗提供了候选抗体（如抗M1R的MB7），更展示了一套高效、低成本、易于推广的抗体开发平台。通过多色四聚体筛选、单细胞扩增与scFv快速评估的整合，该系统实现了从样本到特异性抗体的快速转化，为未来应对新发传染病及肿瘤免疫治疗提供了强有力的技术支撑。