共表达异戊烯二磷酸合酶与底物生成酶实现本氏烟中新型不规则单萜丙二酰葡萄糖苷的高效积累

本研究通过在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中瞬时共表达异戊烯二磷酸合酶（IDS）与底物生成酶（DXS、IDI、HMGR），成功解除了质体与细胞质中DMAPP合成的瓶颈，实现了六种新型不规则单萜丙二酰葡萄糖苷的高效生物合成（最高达6.6 μmol g-1 FW），为可持续植物工厂生产高价值萜类化合物提供了突破性策略。

　　

引言

萜类化合物是自然界中种类最丰富的天然产物，超过八万种结构已被鉴定，其中约四分之三分离自植物。它们具有防御、通讯和抗逆等重要功能，并在药物、化妆品和农用化学品中具有广泛应用。萜类生物合成始于C₅异戊烯基二磷酸异构体——异戊烯基二磷酸（IPP）和二甲烯丙基二磷酸（DMAPP）的缩合，该反应由异戊烯二磷酸合酶（IDS）催化。大多数萜类通过头尾（1’-4）连接方式形成线性骨架，被归类为规则萜。与之相对，数量有限的不规则萜则由两个DMAPP分子通过头中连接直接形成支链或环化结构，具有特殊的生物活性。例如，具有薰衣草醇（lavandulyl）骨架或各种环状结构的化合物常作为昆虫信息素，是开发可持续害虫控制策略的候选分子。天然除虫菊酯（pyrethrins）及其化学合成的类似物拟除虫菊酯（pyrethroids）是高效杀虫剂，其对动物通常无害且能快速生物降解。环薰衣草醇基团（cyclolavandulyl moiety）则是多种具有药用价值化合物的组成部分，例如具有细胞毒性和抗生素活性的吩嗪衍生 Meroterpenoid——lavanducyanin，以及具有神经保护作用的咔唑生物碱 lavanduquinocin。

尽管化学合成各种萜类已取得显著进展，但不规则单萜的生产往往效率低下且可能涉及危险试剂。作为环境友好的替代方案，生物催化方法正在被开发。利用微生物生物工厂生产规则萜类已进行多次尝试，通过广泛的代谢工程和发酵条件优化，倍半萜（如法尼烯）的滴度可达140 g/L。但对于单萜，由于其挥发性和对宿主细胞的毒性，积累水平显著较低。解决这些问题的有效方法是进行原位产物提取或将其转化为挥发性较低、毒性较小的分子。不规则单萜的微生物生产鲜有报道。

更多关于不规则单萜生物技术生产的研究以植物为宿主开展。植物细胞能通过细胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径或质体中的甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径获取前体通量，并具有将酶定位在不同细胞区室的能力。瞬时表达（transient expression）是生产重组蛋白和操纵植物代谢的便捷平台，其优势包括重组蛋白积累水平高、可灵活测试各种基因组合、并能将表达产物限制在特定植物器官中。这为暂时积累对整株植物可能有毒的产物提供了可能。本氏烟（N. benthamiana）中的瞬时表达已被用于证明薰衣草基和菊基二磷酸合酶（LDS和CDS）的功能，但尚未尝试通过扩大前体供应来提高异源不规则单萜的产量。

材料与方法

分析仪器与测定采用LC-ESI-MS和HPLC系统。遗传载体构建使用Golden Braid模块化克隆系统，基因插入包含35S CaMV启动子和胭脂碱合成酶基因终止子的转录单元（TUs）。对于叶绿体转运，在CLDS、IDIs和IPK的TUs中添加了人工叶绿体转运肽序列。通过根癌农杆菌（A. tumefaciens）EHA105菌株将载体导入本氏烟进行瞬时表达，浸润六天后收集生物质。

单萜丙二酰葡萄糖苷的定量通过LC-ESI-MS进行。不规则单萜丙二酰葡萄糖苷的分离采用正相和反相色谱结合TLC纯化，并通过NMR进行结构解析。酸水解和3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮（MPP）衍生化用于确认糖基部分的结构。

结果

瞬时表达异源IDS酶在本氏烟中

研究应用了三种催化不规则缩合的IDS酶：来源于除虫菊（Tanacetum cinerariifolium）的菊基二磷酸合酶（TcCDS）、来源于狭叶薰衣草（Lavandula x intermedia）的薰衣草基二磷酸合酶（LiLDS），以及来源于链霉菌（Streptomyces sp.）的环薰衣草基二磷酸合酶（CLDS）。TcCDS和LiLDS均带有天然的叶绿体转运肽，而细菌来源的CLDS则在其天然形式（无靶向信号）和与人工叶绿体靶向肽融合的形式下进行了测试。

瞬时表达每种不规则IDS酶后，在叶片甲醇提取物中均检测到两种主要的新化合物。这些代谢物被鉴定为菊醇（chrysanthemol）、薰衣草醇（lavandulol）和环薰衣草醇（cyclolavandulol）的6-O-丙二酰-β-D-吡喃葡萄糖苷和6-O-丙二酰-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷衍生物（化合物1-6）。其中，仅菊基-1-O-(6-O-丙二酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷（1）是先前已被表征的化合物。

不规则单萜丙二酰糖苷的结构解析

通过ESI-HRMS和NMR分析（包括TOCSY、CLIP-COSY、HMBC、NOESY），详细解析了这些新分子的结构。单葡萄糖苷化衍生物（1, 3, 5）的分子式为C₁₉H₂₉O₉ ([M–H]^–)，并鉴定为相应的单萜醇通过1-O-β-D-糖苷键与6-O-丙二酰-吡喃葡萄糖连接。双葡萄糖苷化衍生物（2, 4, 6）的分子式为C₂₅H₃₉O₁₄，表明额外连接了一个己糖单元。NMR证实次级糖基化发生在2-O’位，形成了6-O-丙二酰-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷结构。酸水解和MPP衍生化证实所有糖基部分均为D-葡萄糖。基于这些数据，化合物2、4、6分别被鉴定为菊基、薰衣草基和β-环薰衣草基-1-O-(6-O-丙二酰)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，它们代表了一类新的不规则单萜糖苷亚组。

瞬时表达后非挥发性不规则单萜的积累

对于所有三种不规则单萜骨架，丙二酰单糖苷与双糖苷的比例在样品间差异很大。为便于比较，产品产量以每种不规则单萜的两种糖苷化衍生物的总摩尔量表示。表达带有天然叶绿体靶向肽的TcCDS和LiLDS产生了相当量的不规则萜糖苷（1-4）。菊基糖苷积累浓度为0.9 ± 0.3 μmol g^-1 FW，薰衣草基糖苷为0.6 ± 0.3 μmol g^-1 FW。细胞质表达的CLDS形成了更高量的不规则结构（1.1 ± 0.3 μmol g^-1 FW）。当CLDS被转运至叶绿体时，这些产品的产量显著增加（p < 0.01），达到1.9 ± 0.6 μmol g^-1 FW。

支持叶绿体中不规则单萜的生产

增强植物中萜烯积累的常见方法是过表达C5前体生物合成途径中的瓶颈酶。对于质体中的MEP途径，代谢控制分析表明主要的控制酶是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）。然而，当DXS酶与叶绿体定位的TcCDS共表达时，并未观察到糖苷积累的统计学显著增加（p > 0.05）。

不规则萜烯生物合成中的下一个限制因素可能是DMAPP与IPP的不利比例。过表达异戊烯基二磷酸异构酶（IDI）有益于改善这一比例。通过同时解除DMAPP形成的两个瓶颈（DXS反应和通过IDI活性改变IPP与DMAPP的比例），实现了产品形成的显著改善。共表达叶绿体靶向的异构酶与DXS和TcCDS，与单独表达TcCDS或与DXS组合相比，导致菊基糖苷积累显著增加（p < 0.01）。单独共表达TcCDS与IDIs对产品水平没有产生变化（p > 0.05）。共表达TcCDS与MVA途径的瓶颈酶HMGR（无论是否与IDI组合）对产品积累没有影响。

通过异戊烯基磷酸激酶（IPK）回收单磷酸DMAP以增加DMAPP池的可能性也被考虑。然而，共表达的叶绿体靶向AtIPK并未显著增强TcCDS产品积累。

DXS和IDI的共表达也导致薰衣草基糖苷积累的统计学显著增加（p < 0.01），但并未导致由叶绿体靶向CLDS产生的环薰衣草基糖苷水平的显著改善（p > 0.05）。这一结果可能归因于表达ctpCLDS后不规则萜糖苷积累的初始水平较高。

改善细胞质中环薰衣草基骨架的形成

在细胞质中，通过共表达截短的可溶性版本的HMGR1酶（tHMGR）来改善CLDS的产率。与DXS共表达不同，单独加入tHMGR导致环薰衣草基丙二酰糖苷（5, 6）水平的统计学显著增加（p < 0.01）。添加IDI或IPK活性并未进一步促进产品积累。CLDS在细胞质中的活性并未通过过表达叶绿体中MEP途径的瓶颈酶（如DXS单独或与ctpAtIDI组合）而得到显著改善（p > 0.05）。

值得注意的是，共表达CLDS和tHMGR经常引起叶片组织坏死。这种现象仅发生在涉及tHMGR和细胞质CLDS的实验中。大约一半共表达CLDS和tHMGR的叶片出现严重坏死，并显示出可忽略不计的环薰衣草基糖苷水平。这些样品被排除在单萜糖苷水平计算之外。

讨论

考虑到单萜糖基化对于在植物细胞中更容易积累和以可提取形式储存的好处，本研究专注于开发一个在本氏烟叶片中瞬时表达相应IDS基因后生产非挥发性糖基化不规则单萜的平台。糖基化是一个广泛存在于植物界的酶促过程，对次级代谢物的运输、储存和解毒具有重要作用。

植物产生多种多样的糖基化次级代谢物。在单萜组中，过去几十年已从各种植物物种中分离和鉴定出近400种糖苷，其中仅1-2%的糖苷具有用丙二酰基修饰的葡萄糖部分。这些丙二酰糖苷的苷元部分是规则的环状单萜结构。迄今为止，尚未在烟草中报道过天然的丙二酰化糖苷。

在许多单萜中，糖基化形式的积累超过苷元。在本研究中，单萜单糖苷的浓度普遍超过双糖苷，但比例因不同单萜部分而异。不同植物宿主中糖苷积累的变异性可能受到物种特异性糖基化酶活性的影响，而该活性又可能受到异源单萜浓度及其生物合成速率的调节。从植物生理学角度来看，糖基化增强了萜类的水溶性和稳定性，促进了萜类向液泡的转移和储存，并降低了对植物细胞的毒性。在瞬时表达过程中，异源IDS的快速合成以及随后产物的密集形成，可能刺激与代谢物运输和解毒相关的细胞内机制，进一步促进糖基化。

转基因植物组织中异源非挥发性单萜的报告浓度范围在0.07至0.7 μmol g^-1 FW之间。在本实验中，植物来源的天然质体靶向LiLDS和TcCDS与辅助底物生成酶DXS和IDI的瞬时共表达，导致薰衣草基和菊基糖苷在1.4 ± 0.3和1.6 ± 0.4 μmol g^-1 FW的水平上积累。与人工叶绿体靶向肽融合的原核CLPS允许以非挥发性单糖苷和双糖苷形式积累2.2 ± 0.7 μmol g^-1 FW的环薰衣草醇。后者最初较高的水平并未通过增强MEP途径的代谢谢通量和通过过表达DXS和IDI加强IPP向DMAPP的异构化而得到统计学上的进一步显著增加。随后关于细胞质中不规则单萜形成的实验表明，观察到的产品浓度接近植物细胞对这些化合物的耐受阈值。

在细胞质中共表达CLDS和tHMGR导致组织中环薰衣草基糖苷的最高浓度。MVA途径对于萜烯生产的显著更好性能已在微生物宿主中反复证明。在本实验中，HMGR与CLDS的共表达经常引起叶片坏死，这在每种酶单独或任何其他蛋白质组合中均未观察到。我们假设，要么产生的单萜量超过了糖基化系统的能力，导致有毒游离醇的积累，要么丙二酰糖苷在高浓度下也有毒性。共表达CLDS和HMGR后，环薰衣草基糖苷的平均水平达到3.9 ± 1.5 μmol g^-1 FW；最佳样品含有6.6 μmol g^-1 FW的这些化合物。这些值代表了从植物系统中分离的不规则单萜的最高报告浓度。获得的化合物可以以糖基化形式测试生物活性，或用于获取苷元，这些苷元可以转化为已知的有价值的衍生物。

结论

为促进不规则单萜的可持续植物基生产，我们建立了一种瞬时程序，通过共表达IDS基因和MEP或MVA途径的底物生成酶基因，增强本氏烟中向DMAPP的生物合成通量。这使得大量非挥发性糖基化不规则单萜衍生物得以积累。我们鉴定出五种新的薰衣草醇、环薰衣草醇和菊醇代谢物，以及先前描述的菊基-6-O-丙二酰-β-D-吡喃葡萄糖苷。解除关键酶底物生物合成中的瓶颈，导致了植物系统报告的不规则单萜的最高产量。