CAMKK2通过AMPK/PGC-1α信号通路调控线粒体动力学稳态缓解肺纤维化的机制研究

本研究针对特发性肺纤维化（IPF）中线粒体功能障碍的关键问题，揭示了钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶2（CAMKK2）在肺成纤维细胞中的调控机制。研究人员通过体内外实验证实，CAMKK2表达下调会加剧线粒体动力学失衡和氧化磷酸化功能障碍，而过表达CAMKK2可通过激活AMPK/PGC-1α信号通路，恢复线粒体融合蛋白MFN1/MFN2表达，抑制DRP1介导的分裂，从而改善线粒体功能并减轻纤维化。该研究为IPF治疗提供了新的靶点策略，发表于《Molecular Medicine》期刊。

　　

在呼吸系统疾病领域，特发性肺纤维化（IPF）如同一道难以破解的医学谜题，其特征是肺组织进行性瘢痕形成和功能丧失。这种致命性肺疾病的典型病理改变包括成纤维细胞异常活化、细胞外基质（ECM）过度沉积，以及肺泡结构的不可逆破坏。尽管现有药物如吡非尼酮和尼达尼布能够延缓疾病进展，但患者中位生存期仍仅3-5年，且无法实现根治。近年来，越来越多的证据表明线粒体功能障碍在IPF发病机制中扮演着关键角色——IPF患者的肺成纤维细胞表现出线粒体质量减少、膜结构受损、嵴形态异常等特征，这些异常改变如何调控成纤维细胞活化已成为领域内亟待解决的核心问题。

在这项发表于《Molecular Medicine》的研究中，Zhou等研究人员将目光投向了钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶2（CAMKK2）。该蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，既往研究揭示其在糖尿病肾病中调控线粒体动力学和ROS产生，并通过CAMKK2-AMPK依赖通路协调线粒体分裂和线粒体自噬。然而，CAMKK2在肺纤维化中的作用机制尚不明确。本研究通过整合临床样本分析、动物模型验证和细胞分子实验，系统阐述了CAMKK2通过AMPK/PGC-1α信号通路调控线粒体动力学稳态，进而影响肺纤维化发生发展的新机制。

研究人员采用的主要技术方法包括：利用IPF患者肺组织样本和非IPF对照组织进行免疫组化分析；通过腺相关病毒AAV6载体介导的基因过表达技术构建Camkk2过表达小鼠模型；使用博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型进行体内功能验证；采用人胚肺成纤维细胞系MRC-5和原代培养的人/小鼠肺成纤维细胞进行体外机制研究；通过蛋白质免疫印迹（Western blotting）和实时定量PCR（RT-qPCR）分析关键分子表达；应用线粒体功能检测技术（包括ROS测定、JC-1线粒体膜电位检测、ATP含量测定和Seahorse线粒体呼吸测定仪分析氧消耗率OCR）；采用细胞迁移（Transwell）、胶原凝胶收缩和伤口愈合实验评估成纤维细胞活性；使用特异性抑制剂（STO-609、Compound C和SR-18292）进行信号通路验证。

CAMKK2表达与线粒体动力学在纤维化肺中的改变

研究人员通过对GSE47460数据库的重新分析发现，IPF患者肺组织中CAMKK2、PPARGC1A（编码PGC-1α）和MFN2的mRNA表达显著下调。在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型和TGF-β1刺激的MRC-5细胞中，同样观察到CAMKK2蛋白和mRNA水平的显著降低。免疫组化结果显示CAMKK2主要与α-SMA+成纤维细胞共定位，而在SPC+上皮细胞中极少检测。Western blotting分析进一步证实纤维化肺组织中PGC-1α、MFN2和MFN1表达下降，而纤维化标志物COL1A1表达上升。

抑制CAMKK2增强成纤维细胞活化和ECM产生

使用选择性CAMKK2抑制剂STO-609处理MRC-5细胞后，发现纤维化标志物（FN1、COL1A1和α-SMA）在mRNA和蛋白水平均进一步升高。Transwell实验显示CAMKK2抑制显著增强了细胞迁移活性，胶原凝胶收缩实验也表明细胞收缩活性增强。在原代小鼠肺成纤维细胞中，STO-609处理同样上调了COL1A1和α-SMA表达。通过shRNA敲低CAMKK2的实验进一步验证了这些表型，证实了CAMKK2抑制对成纤维细胞活化的促进作用。

过表达CAMKK2抑制TGF-β1刺激的成纤维细胞活化和ECM产生

通过Flag-CAMKK2过表达质粒转染MRC-5细胞，研究人员发现过表达CAMKK2可显著降低TGF-β1诱导的FN1、COL1A1和α-SMA表达。细胞迁移实验（Transwell和伤口愈合）显示CAMKK2过表达部分逆转了TGF-β1刺激的迁移活性增强，胶原凝胶收缩实验也表明过表达CAMKK2抑制了成纤维细胞收缩活性。在原代人肺成纤维细胞中，CAMKK2过表达同样降低了纤维化标志物表达。

CAMKK2调控TGF-β1刺激的成纤维细胞线粒体动力学

线粒体功能检测结果显示，CAMKK2过表达显著降低了MRC-5细胞中的ROS水平，改善了TGF-β1诱导的线粒体膜电位（MMP）降低，提高了ATP合成含量和最大呼吸容量。Mito-tracker红色荧光染色显示CAMKK2过表达恢复了线粒体网络形态，增加了线粒体长度。Western blotting分析表明CAMKK2过表达促进了线粒体融合蛋白（MFN1和MFN2）表达，降低了线粒体分裂蛋白（DRP1）表达。

CAMKK2通过AMPK/PGC-1α信号通路调控线粒体动力学稳态

机制研究发现，CAMKK2过表达激活了AMPK在苏氨酸172位点的磷酸化（pT172-AMPK）。使用AMPK抑制剂Compound C处理可部分逆转CAMKK2过表达对MFN2、MFN1和PGC-1α的上调作用。进一步使用PGC-1α特异性抑制剂SR-18,292处理发现，抑制PGC-1α显著降低了线粒体融合蛋白表达，增加了ROS水平，降低了ATP含量和呼吸容量，并部分逆转了CAMKK2过表达对OXPHOS复合物（ND1-C-I、CYTB-C-III、MT-CO2-C-IV和ATP8-C-V）表达的上调作用。功能实验表明SR-18,292处理还部分恢复了成纤维细胞收缩活性和纤维化标志物表达。

Camkk2减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化

体内实验显示，通过AAV6载体气管内递送Camkk2可显著减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。Micro-CT成像、H&E和Masson染色结果表明Camkk2过表达减少了肺组织损伤和胶原沉积。Camkk2治疗组小鼠的肺/体重比、BALF总炎症细胞计数、BALF蛋白水平和羟脯氨酸含量均显著降低。分子水平分析显示Camkk2过表达提高了肺组织中PGC-1α、MFN2和MFN1蛋白表达，降低了纤维化标志物（Vimentin和α-SMA）表达。

本研究得出结论：CAMKK2在肺纤维化中表达下调，其过表达可通过激活AMPK/PGC-1α信号通路，恢复线粒体动力学稳态，改善线粒体功能，从而抑制成纤维细胞活化和ECM产生，最终减轻肺纤维化。这一发现不仅深化了对IPF发病机制的理解，更重要的是为开发靶向CAMKK2的新型治疗策略提供了坚实的实验依据，具有重要的临床转化价值。

研究的创新性在于首次系统阐明了CAMKK2在肺纤维化中线粒体动力学调控中的作用机制，并证实了AMPK/PGC-1α信号通路在这一过程中的核心地位。然而，研究也存在一定局限性，如使用MRC-5胚胎成纤维细胞而非IPF患者原代成纤维细胞，以及未探讨CAMKK2在上皮细胞和巨噬细胞中的作用。未来研究需要利用细胞特异性条件敲除小鼠进一步验证CAMKK2在不同细胞类型中的功能，并为临床转化研究提供更多证据支持。