综述：昆虫细胞表达系统：应用进展、工程策略与生物过程开发

本综述系统梳理了昆虫细胞-杆状病毒表达系统（BEVS）在生物医药领域的创新应用与前沿突破。平台凭借其高效真核表达优势，在新冠疫苗（如NVX-CoV2373）、病毒样颗粒（VLP）、基因治疗载体（rAAV）及复杂结构蛋白生产中展现巨大潜力。文章重点探讨了CRISPR-Cas9基因编辑、幼虫生物反应器、杆状病毒展示等新兴技术，同时深入分析规模化生产瓶颈与监管指南，为下一代生物制造提供战略视角。

　　

拓展中的生物医学应用

随着技术和监管指南的持续完善，昆虫细胞表达系统作为生产生物药物的潜力平台日益受到关注。COVID-19大流行使重组蛋白疫苗走向台前，例如采用该平台生产的Novavax新冠疫苗NVX-CoV2373已在全球获批，包括美国2024-2025年更新配方。中国也紧急授权了两款基于昆虫细胞的COVID-19疫苗，标志着生物制药创新的重要成就。这些进展突显了该平台在应对新发传染病中的关键作用。

该系统最初为重组蛋白表达而开发，现已成为多功能的生物制造平台，广泛应用于疫苗抗原、治疗性蛋白、基因递送与治疗及组织工程等领域。

人用疫苗开发

该系统的灵活性在快速开发和及时更新疫苗方面发挥关键作用，特别是在应对新发病原体和持续演变的病毒变种时。针对COVID-19，已开发多款昆虫细胞来源的疫苗，包括Novavax的NVX-CoV2373、WestVac的Co Prevtyn Beta和Vaxine的SpikoGen^?。其中，NVX-CoV2373采用草地贪夜蛾Sf9细胞表达的重组刺突蛋白，临床试验效力达89.7%。WestVac Biopharma的重组受体结合域（RBD）疫苗同样使用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，在动物模型中诱导了强抗体反应和有效病毒中和。随着SARS-CoV-2持续进化，WestVac还开发了三聚体RBD疫苗，将Delta变体RBD与七肽重复序列1（HR1）和HR2融合，在临床前研究中显示出增强的免疫原性和广泛保护效果。在此基础上，他们进一步研发了三价疫苗（Tri-Vac），包含Delta、BA.5和XBB.1.5变体的RBD三聚体，在临床试验（ChiCTR2200067245）中表现出强效交叉中和活性和持续免疫反应，凸显其作为广谱SARS-CoV-2疫苗的潜力。此外，SpikoGen^?和VidPrevtyn Beta也在临床试验中显示出强免疫原性，进一步证明了昆虫细胞衍生疫苗的优势。

该平台在针对多种传染病的疫苗开发中也展示出巨大潜力。Novavax研发了呼吸道合胞病毒（RSV）F纳米颗粒疫苗，在III期试验（NCT02624947）中对重症结局提供了部分保护（39.4-58.8%），且在负担最重的中低收入国家（LMICs）效果显著。其在孕妇中的良好安全性也凸显了用于孕产妇免疫计划的潜力。Novavax的埃博拉病毒糖蛋白（EBOV GP）纳米颗粒疫苗在I期试验（NCT02370589）中显示出强免疫原性，引发的抗体滴度持续长达一年，证明了其作为埃博拉病毒爆发预防措施的前景。另一个值得注意的应用是武田与HilleVax联合开发的双价诺如病毒病毒样颗粒（VLP）疫苗HIL-214，作为目前临床开发中最先进的诺如病毒疫苗候选者之一，在涉及4712名成年人的II期试验（NCT02669121）中显示出预防中重度急性胃肠炎（AGE）的显著效力。在中国，Sinocelltech有限公司利用该平台推进了重组14价人乳头瘤病毒（HPV）VLP疫苗（SCT1000）的开发，该候选疫苗目前正在进行III期评估（NCT06041061），初步数据显示出强免疫原性和优异安全性，为广谱HPV预防提供了有前景的策略。同样，康希诺生物利用Sf-RVN昆虫细胞系统开发了重组三价脊髓灰质炎病毒VLP疫苗（VLP-Polio），现已进入I期临床试验（NCT06101173），这为更安全、更可持续的脊髓灰质炎疫苗解决方案迈出了关键一步。

兽用疫苗生产

兽医领域对可扩展且经济高效的疫苗平台的需求日益紧迫。昆虫细胞表达系统已成为兽用疫苗开发的领先平台，在真核蛋白处理能力和工业可扩展性之间提供了最佳平衡。该系统已应用于针对猪瘟病毒（CSFV）的亚单位疫苗和猪圆环病毒2型（PCV2）的VLP疫苗，两者均已实现商业化。近期研究验证了这些疫苗的强大保护效力。

基于VLP的下一代亚单位疫苗因其高免疫原性、对天然病毒的结构模拟以及无遗传物质带来的卓越安全性而获得发展势头。昆虫细胞系统非常适合VLP生产，支持对自组装和抗原性至关重要的正确蛋白质折叠和翻译后修饰。由瘟病毒A（BVDV-LC）E0和E2蛋白组成的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）VLPs在昆虫细胞中成功自组装成球形颗粒，并在动物模型中引发强烈的免疫反应。对于猪丁型冠状病毒（PDCoV），昆虫细胞衍生的VLPs有效刺激了小鼠中的特异性免疫反应，突出了其作为PDCoV疫苗候选者的潜力。使用昆虫细胞生产的H5N1流感VLPs表现出强免疫原性，单次低剂量免疫即可诱导高血凝抑制抗体滴度，并对同源高致病性禽流感病毒（HPAIV）攻击提供保护性免疫。罗氏沼虾诺达病毒（MrNV）衣壳蛋白VLPs已被表达、纯化并给予淡水虾，在病毒攻击后显著提高了存活率。

这些发现共同强调了昆虫细胞表达系统在生产兽用VLP疫苗方面的多功能性和有效性。其支持多价抗原表达、结构完整性和强免疫原性的能力，使其成为针对陆生和水生物种的下一代疫苗的理想平台。

治疗性重组蛋白

美国食品药品监督管理局（FDA）对Provenge（Sipuleucel-T）的批准标志着生物技术应用于癌症治疗的一个关键里程碑。研究人员已广泛探索昆虫细胞表达系统作为治疗性重组蛋白生产的创新系统，在重组蛋白表达、可扩展生产和工艺开发方面取得了显著进展。

昆虫细胞能够正确折叠抗体分子并引入特异性糖基化修饰，这对增强抗体的活性和稳定性至关重要。然而，病毒感染引起的瓶颈显著影响抗体生产，且最终产量相对较低限制了该平台在抗体表达中的更广泛应用。尽管存在这些挑战，研究人员仍在继续探索创新解决方案。例如，采用无杆状病毒昆虫细胞系统实现高产抗体表达，并利用强昆虫细胞启动子建立瞬时基因表达系统或开发稳定转基因细胞系，以高效生产HIV-1广谱中和抗体b12。此外，家蚕-杆状病毒表达系统已成功生产出针对SARS-CoV-2的CR3022抗体的scFv、Fab和IgG。这些进展表明，昆虫细胞表达系统作为生产具有生物活性的单克隆抗体的替代平台具有巨大潜力。

更广泛地说，在重组蛋白治疗领域，该系统已成功用于生产结构复杂且具有功能活性的蛋白质和VLPs，这些通常需要二硫键形成或糖基化以实现正确折叠和生物学功能。代表性例子包括丝光绿蝇胶原酶（MMP-1）、蛇毒L-氨基酸氧化酶（SR-LAAO）、Fc融合蛋白和骨髓酪氨酸激酶（BMX）。这些研究建立了可扩展的生产工艺，并开发了安全、多功能的昆虫细胞表达系统生产平台。在治疗性VLP开发领域，昆虫细胞平台同样展现出显著潜力。例如，犬细小病毒-VLPs特异性靶向癌细胞上的转铁蛋白受体（TFRs）。此外，在昆虫细胞中生产的HER2靶向VLPs（带有昆虫型糖基化）在HER2阳性乳腺癌小鼠模型中显示出显著的保护效果。

总而言之，这些发现凸显了昆虫细胞表达系统作为重组蛋白生产强大且适应性强的平台。其支持正确蛋白质折叠、翻译后修饰和VLP组装的独特能力，使其特别适合生成复杂的治疗性蛋白质和生物纳米载体，从而促进生物药物开发和精准靶向治疗的进步。

复杂结构蛋白的基础研究

在蛋白质结构、功能和相互作用组分析中，实现高产、高纯度和高活性的蛋白质生产仍然是一个重大挑战。昆虫细胞表达系统已成为一个多功能平台，特别适用于同时表达多个蛋白质和高效生产多亚基蛋白质复合物。为了进一步优化这一过程，已开发了几种先进的杆状病毒载体平台。这些包括HR-bac（利用同源重组高效组装和表达多基因表达盒）、PluriBAC（采用Golden Gate组装实现超过四个启动子、目的基因和终止子序列的模块化组合，以实现灵活的多基因表达）和MoClo-Baculo（一个酵母兼容的替代表达系统，支持使用模块化克隆（MoClo）策略高效构建多基因表达盒）。这些工具能够实现多基因表达和蛋白质复合物的高水平生产，促进功能系统的快速组装以用于结构研究。

基于昆虫细胞表达系统的平台克服了生产高产、活性蛋白质的常见挑战。例如，Sousa等人从5升悬浮培养物中在34天内生产了100毫克纯化的BMX，使得能够对BMX抑制剂进行潜在的高通量筛选。重组醛氧化酶（AOX）是一种复杂的含钼蝶呤黄素蛋白，传统上难以生产。这允许通过简化的两步过程高效生产和分离具有高纯度的重组人AOX二聚体。该方法为肝脏提取物提供了可靠的替代方案，确保了在药物开发中准确评估AOX代谢。在BSL-4设施中处理尼帕病毒（NiV）限制了使用野生型病毒进行药物筛选的实用性。为了解决这个问题，开发了一个表达NiV-F、NiV-G和EphrinB2的基于昆虫细胞的平台，以重建NiV诱导的合胞体形成。该平台能够筛选具有阻断病毒进入潜力的融合抑制化合物。

除了蛋白质表达，在生产细胞内结晶重组蛋白质是一种罕见但有价值的结构研究策略。利用基于杆状病毒的克隆系统，研究人员优化了细胞环境以提高细胞内结晶效率。Tang等人开发了一个网关兼容杆状病毒载体库，并建立了一个可扩展的管道，该管道整合了手性晶体二阶非线性成像（SONICC）和透射电子显微镜（TEM）技术，以筛选活昆虫细胞中的微晶形成。在此基础上，Schonherr等人开发了InCellCryst方法，该方法整合了高通量表达、增强的晶体细胞富集和直接在昆虫细胞中进行X射线衍射。这些进展凸显了昆虫细胞表达系统在使结构生物学能够利用细胞内结晶进行蛋白质结构分析方面的潜力。此外，硒代甲硫氨酸（SeMet）标记的蛋白质可以方便地在细胞内检测。一种将SeMet标记与质量控制的滴度估计（TEQC）方法相结合的新方法允许精确控制感染水平，从而降低SeMet相关毒性并显著提高标记重组蛋白的生产效率。

这些进展共同强调了昆虫细胞表达系统作为生产具有结构和功能相关性的蛋白质的强大且可扩展平台的通用性和可扩展性，为其在药物发现、功能蛋白质组学和结构生物学中的更广泛应用铺平了道路。

驱动平台创新的新兴技术

昆虫幼虫作为重组蛋白生物生产的可扩展系统

昆虫细胞表达系统不仅限于昆虫细胞培养；它还可以利用昆虫幼虫或蛹生产重组蛋白，从而自身成为一个重要且多功能的生物生产系统。使用昆虫幼虫作为生物反应器具有高成本效益，并便于大规模重组蛋白生产，且易于扩展。监管当局批准的代表性产品包括使用家蚕幼虫开发的Virbagen^? Omega和使用粉纹夜蛾（T. ni）蛹生产的兔出血病病毒（RHDV）疫苗Fatro