基于多组学联用策略揭示重楼叶片特异性黄酮生物合成机制及其资源开发潜力

本研究针对药用植物重楼(Paris polyphylla Sm.)中具有重要药理活性的黄酮类成分研究不足的问题，通过整合非靶向代谢组学、靶向代谢组学、转录组学和RT-qPCR验证等多组学技术，系统揭示了不同组织部位黄酮代谢差异及其生物合成机制。研究发现叶片是黄酮类成分的主要富集部位，鉴定出山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素3-β-D-葡萄糖苷和芦丁等关键活性成分，并阐明CHI、CHS和FLS等关键酶在黄酮合成通路中的调控作用。该研究为重楼非药用部位的资源化利用提供了重要科学依据，促进了珍贵中药资源的可持续发展。

　　

在传统中药宝库中，重楼(Paris polyphylla Sm.)犹如一颗璀璨的明珠，其根茎作为云南白药、宫血宁胶囊等著名中药制剂的核心原料，早已闻名遐迩。这种隶属于黑药花科的珍稀植物，不仅在中国有着悠久的药用历史，还分布于不丹、越南、印度和尼泊尔等地区，主要生长在森林、草地或山坡上。然而，由于栖息地破坏和非法采挖，野生重楼种群数量急剧下降，已被世界自然保护联盟(IUCN)列为"易危"物种。

现代药理研究表明，重楼富含多种活性成分，其中甾体皂苷类成分因具有抗炎、抗菌、免疫调节等活性而被广泛研究。但令人惊讶的是，同样具有重要药理价值的黄酮类成分却长期被忽视。黄酮类化合物具有两个苯环(A和B环)和多个酚羟基的基本骨架，主要包括查耳酮、黄酮、黄酮醇、黄烷二醇、花青素和缩合单宁等六大类。这些化合物表现出广泛的生物活性，包括抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎和抗肿瘤等作用。截至2024年，已有19种黄酮类药物获批上市，其中天然黄酮类药物占52.6%，还有36种黄酮类临床候选药物正处于不同研发阶段。

虽然目前对重楼中黄酮类成分的研究尚不充分，但已有少数研究提示这类成分可能是重楼的重要药理活性物质。例如，张等人发现黄酮类是重楼根中的主要物质之一，苏等人也在重楼叶片中发现了山奈酚3-葡萄糖苷等黄酮类化合物。然而，这些研究仍主要集中于重楼甾体皂苷的探索，对黄酮类成分缺乏系统深入的研究。

近年来，代谢组学技术已被广泛应用于植物小分子代谢物的高通量分析，而转录组学则用于分析植物基因表达谱。将代谢组学与转录组学相结合，可以实现从基因到代谢物的全面生理机制解析。许多植物的代谢组和RNA-seq谱已被用于揭示化合物合成机制和不同植物物种的动态变化，包括菊花、烟草、白术、黄芪等。当然，代谢组学和转录组学也可用于研究黄酮类的生物合成机制。

为了解决重楼不同组织(叶、茎和根)中黄酮类成分的种类和分布问题，研究人员采用代谢组学结合转录组学的方法对重楼不同组织进行了分析。当前，中药材非传统药用部位的利用是中药资源发展趋势之一。作为珍贵的中药材，研究重楼中黄酮类成分的分布、含量及生物合成机制，将促进其发展，特别是非药用部位的合理利用。

本研究主要采用了多组学整合分析策略：首先通过非靶向代谢组学(HPLC-MS/MS)检测不同组织的代谢物谱，使用Waters HSS T3色谱柱和Thermo Q Exactive HFX高分辨质谱系统进行分析；采用转录组学(Illumina HiSeq X Ten平台)进行基因表达谱分析，通过HISAT2进行序列比对和StringTie进行转录本组装；针对筛选出的39种黄酮代谢物开展靶向代谢组学验证；选择29个黄酮合成关键基因通过RT-qPCR进行表达验证。所有实验均设置生物学重复(代谢组学n=6，转录组学和RT-qPCR n=4/3)，样本来源于湖北医药学院附属国药东风总医院药学系鉴定的7年生重楼植株。

非靶向代谢组学揭示重楼代谢物特征

通过非靶向代谢组学分析，在重楼根、茎、叶组织中共检测到332种代谢化合物，其中黄酮类占19.49%，羧酸及衍生物占18.41%，脂肪酰基占7.94%，酚酯类脂质占6.86%，有机氧化合物占5.78%。主成分分析(PCA)显示三类组织间存在明显差异，QC样本聚集一致性高，95.72%的代谢特征符合70%重现性阈值，90%以上代谢物的相对标准偏差(RSD)低于10%，证实了分析系统的稳定性和数据集的可靠性。

正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)结果显示，三组比较组(根、茎、叶)呈现明显聚类。通过P值<0.05和VIP>1的筛选标准，叶与根组比较获得45个差异代谢物(DMs)，其中26个上调，19个下调，黄酮类代谢物占比最高(35%)；叶与茎组比较获得38个DMs，20个上调，18个下调，黄酮类占45.45%；茎与根组比较获得52个DMs，33个上调，19个下调，黄酮类占25.53%。Upset图分析发现6'-O-L-阿拉伯吡喃糖基黄芪苷、vincetoxicoside A、木犀草素-3,7-二-O-葡萄糖苷、木犀草素4'-葡萄糖苷和非瑟定等5个黄酮代谢物在根、茎、叶中表达水平存在显著差异。

转录组学解析基因表达差异

转录组学测序共获得1,026,924,376条高质量clean reads，Q30百分比在93.76%至97.16%之间，GC含量介于45.91%-47.57%。PCA分析显示组内聚集良好，组间分离明显。通过|FC|≥2和错误发现率(FDR)<0.05的阈值筛选差异表达基因(DEGs)，叶与根组比较获得17,088个DEGs，叶与茎组比较获得14,773个DEGs，茎与根组比较获得15,089个DEGs。

KEGG通路富集分析显示，所有比较组中黄酮醇生物合成通路均显著富集。黄酮醇生物合成相关基因分析表明，羟基肉桂酰转移酶(HCT)、查尔酮异构酶(CHI)、黄酮醇合酶(FLS)、查尔酮合酶(CHS)和黄烷酮3-羟化酶(F3H)在叶片中高表达，茎中次之；无色花青素双加氧酶(LDOX)、细胞色素P45098A2(CYP98A2)、柚皮素7-O-甲基转移酶(NB40MT)、肉桂酸4-羟化酶(CYP73A)在茎中表达最高，根中次之；二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)在叶和茎中表达高于根。转录组分析表明，黄酮生物合成基因在叶和茎中显著上调，提示这些组织是重楼中大多数分类黄酮生物合成的主要场所。

多组学联合分析揭示代谢通路

代谢组学和转录组学数据的PCA联合分析显示组间样本分离显著，组内相似性高，支持其联合分析的兼容性。DMs和DEGs的KEGG通路交叉分析显示，叶与根组共有36条通路，叶与茎组共有36条通路，茎与根组共有44条通路。Ko00941是黄酮类生物合成信号通路，其中叶与根组主要涉及40个DEGs和4个DMs，叶与茎组主要涉及48个DEGs和4个DMs，茎与根组不涉及。这些结果表明重楼叶片是黄酮生物合成的核心部位。

DEGs和DMs的整合揭示了黄酮类代谢物生物合成中的关键调控机制。在黄酮类代谢物的生物合成途径中，DMs主要涉及根皮苷、木犀草素、山奈酚、二氢非瑟酮和槲皮素。在比较组中，编码CHS(K00660)的基因表达上调与根皮苷的增加相关；编码CHS(K00660)、CHI(K01859)和F3H(K00475)的基因协调上调可能增强了一氢非瑟酮的生物合成；在叶与根组比较中，CHS(K00660)、CHI(K01859)、F3H(K00475)和FLS(K05278)上调，导致对香豆酰辅酶A转化为山奈酚；在叶与茎组比较中，F3H(K00475)表达不变；在茎与根组比较中，黄酮生物合成相关通路上调。

靶向验证关键代谢物

为了进一步验证非靶向代谢组学筛选出的黄酮DMs，研究人员对黄酮DMs及其相关代谢物进行了靶向代谢组学验证，共涉及39种代谢物，其中25种代谢物被成功检测。研究发现，在黄酮类及其生物合成前体中，芦丁、槲皮素3-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷等代谢物在叶片中含量较高(P<0.05)。具体而言，叶片中芦丁、槲皮素3-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷的含量分别占3.126%、0.255%和6.423%；茎中这三种成分的含量分别为0.245%、0.142%和0.475%。其中，叶片中芦丁和山奈酚-3-O-葡萄糖苷的含量超过1%，表明其具有工业化提取潜力。

关键基因的RT-qPCR验证

根据转录组学结果，研究人员选择了29个基因(编码14种黄酮生物合成相关酶)进行RT-qPCR验证，其中5个基因在组间无显著差异(p>0.05)。结果具体涉及C4H(肉桂酸4-羟化酶)、黄酮3'-羟化酶(F3'H)、F3H(黄烷酮3-羟化酶)、FLS(黄酮醇合酶)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)、HCT(羟基肉桂酰转移酶)、咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶(CCoAOMT)、CHS(查尔酮合酶)、DFR(二氢黄酮醇4-还原酶)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、LDOX(无色花青素双加氧酶)、CHI(查尔酮异构酶)、CYP98A2(细胞色素P45098A2)、黄酮合酶(FNS)。F3'H、FLS、PAL等黄酮生物合成相关酶在叶片中表达水平最高(P<0.05)。这些基因的RT-qPCR检测结果与转录组数据一致。

重楼黄酮代谢物的生物合成过程

基于上述研究成果，研究人员梳理了重楼中黄酮类代谢物的生物合成机制。黄酮类的生物合成途径基于通过莽草酸途径合成的苯丙氨酸，然后通过苯丙烷途径中的关键酶(PAL、C4H、4CL)转化为对香豆酰辅酶A，随后通过CHS产生柚皮素查尔酮。柚皮素查尔酮在CHI的作用下异构化为柚皮素。RT-qPCR验证显示CHI整体表达水平较低，表明它可能是黄酮生物合成中的限速酶。F3'H使重楼中的黄酮生物合成倾向于黄酮醇代谢物。FLS在叶片中上调，导致二氢槲皮素和二氢山奈酚更多地流向槲皮素和山奈酚的产生，这与槲皮素和山奈酚衍生物含量较高的靶向代谢组学验证结果一致。

研究结论与意义

本研究通过整合多组学分析技术，首次系统揭示了重楼不同组织部位黄酮类成分的分布规律和生物合成机制。研究发现叶片是黄酮类成分的主要富集部位，其中芦丁、槲皮素3-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷等活性成分具有工业化提取潜力。在重楼黄酮生物合成机制研究中，发现CHI、CHS和FLS等关键酶发挥着重要作用。

该研究的重要意义在于为重楼非药用部位特别是叶片的药用或营养补充剂利用提供了科学依据，促进了其资源开发和利用。传统上重楼的药用部位主要为根茎，而叶片往往被废弃。本研究发现在重楼叶片中富含具有重要药理活性的黄酮类成分，如芦丁具有通过下调AGE-RAGE信号通路减轻银屑病炎症的作用；槲皮素3-β-D-葡萄糖苷作为槲皮素的衍生物，具有抗乳腺癌细胞增殖作用；山奈酚-3-O-葡萄糖苷则对年龄相关认知障碍具有保护作用。

从合成生物学角度看，该研究阐明的黄酮生物合成通路和关键限速酶为通过代谢工程手段提高重楼黄酮产量提供了理论依据。研究人员发现的CHI作为潜在限速酶，以及F3'H和FLS在叶片中的高表达特征，为未来通过基因编辑或过表达策略优化黄酮合成通路指明了方向。

此外，该研究采用的多组学整合分析策略为其他药用植物的活性成分研究提供了可借鉴的方法学框架。通过非靶向代谢组学筛选候选代谢物，结合转录组学识别关键基因，再通过靶向代谢组学和RT-qPCR进行验证的研究路径，能够系统解析植物次生代谢物的生物合成机制。

该研究成果发表在《BMC Plant Biology》期刊，不仅丰富了重楼药用价值的研究内涵，也为珍贵中药资源的可持续利用提供了新思路。未来研究可进一步探讨这些黄酮类成分的具体药理活性及其作用机制，以及通过栽培技术或生物工程手段提高黄酮含量的可行性，从而充分发挥重楼这一珍贵中药资源的综合价值。