叶绿体基因组解析小球藻科系统发育与进化：揭示光合作用丧失下的适应性演化

本研究针对小球藻科(Chlorella-ceae)系统发育关系不清、进化路径不明等难题，通过对58个叶绿体基因组(plastome)进行 phylogenomic 分析，首次揭示了主要谱系的亲缘关系，发现IR区存在三次独立丢失事件，并揭示了专性异养类群在plastome大小、基因含量和密码子使用偏好性(codon usage bias)方面的适应性变化，为微藻资源开发利用提供了重要理论基础。

　　

在微藻研究领域，小球藻科(Chlorellaceae)堪称一颗耀眼的明星。其家族成员如小球藻(Chlorella)、异形藻(Auxenochlorella)和小环藻(Micractinium)等，不仅在生态系统中扮演着重要角色，更在食品、医药、保健品、能源和农业等领域展现出巨大的经济价值。特别是小球藻，作为具有重大科学研究价值和经济潜力的微藻，已经吸引了无数科学家的目光——在谷歌学术上搜索"Chlorella"，可以得到约48.8万条结果。

然而，这个重要的微藻家族却存在着令人困扰的分类学难题。许多成员具有简单的球状形态特征，难以区分，导致分类系统混乱不堪。更复杂的是，该科包含了自养物种(大多数成员)、混养物种(Auxenochlorella)和专性异养物种(原壁菌Prototheca和卷旋孢菌Helicosporidium)，这种生活策略的多样性使其成为研究不同生命策略进化模式的理想对象。

长期以来，研究人员使用18S rDNA和ITS2等分子标记进行分类和系统发育研究，但这些问题依然悬而未决：各分支间和属间的亲缘关系不明确，进化路径模糊不清，以及属的多系性(如Chlorella)等问题持续存在。要提高系统发育推断的精确性，需要更多信息丰富的核苷酸位点。

叶绿体基因组(plastome)因其大小适中、基因含量相对保守、进化速率适中等特点，成为绿藻门(Chlorophyta)系统发育重建的强大分子标记。其独特的结构，包括位于大单拷贝区(LSC)和小单拷贝区(SSC)的单拷贝蛋白编码基因，不仅消除了旁系同源干扰，还提供了丰富的信息位点。最近的研究表明，小球藻科叶绿体基因组的进化涉及基因重排、选择性基因丢失和动态内含子增殖等复杂适应过程，为了解不同生态策略下绿藻基因组可塑性提供了关键见解。然而，该科的质体基因组数据仍然有限，尤其是副小球藻(Parachlorella)分支，截至本研究前仅有两个质体基因组被报道。

为了突破这些限制，Song等研究人员在《BMC Plant Biology》上发表了他们的最新研究成果。他们新测序了21个小球藻科质体基因组，包括首次报道的棘球藻(Actinastrum)、双形藻(Didymogenes)、马赛藻(Masaia)、网孢藻(Dictyosphaerium)、拟细线藻(Closteriopsis)、新小球藻(Neochlorella)、十字藻(Crucigenia lauterbornii)和冠球藻(Coronastrum ellipsoideum)的质体基因组，以及几个未分类的类群。结合之前发表的37个质体基因组数据，总共分析了58个质体基因组，代表了所有主要分支。

研究采用了多种关键技术方法：通过单细胞分离培养获得21个小球藻科菌株；使用Illumina平台进行全基因组测序；利用GetOrganelle工具进行质体基因组组装和注释；基于79个蛋白质编码基因进行系统基因组学分析，包括分区和非分区的超矩阵分析以及基于多物种 coalescent 的分析方法；比较分析IR区边界和基因含量；使用CodonW软件分析密码子使用偏好性(RSCU)。

研究结果揭示了小球藻科质体基因组的惊人多样性。质体基因组大小从28,638 bp(原壁菌Prototheca zopfii)到176,851 bp(普通小球藻Chlorella vulgaris)不等；GC含量在25.7%(沼泽原壁菌Prototheca stagnorum)和38.2%(双生马瓦藻Marvania geminata)之间变化；蛋白编码基因数量从19个(牛原壁菌Prototheca bovis)到89个(假绿藻Pseudochloris wilhelmii)不等。

系统基因组分析取得了突破性进展。三种分析方法(分区超矩阵、非分区超矩阵和基于 coalescent 的方法)产生了高度一致的拓扑结构，为几个关键亲缘关系提供了强力支持。小球藻(Chlorella)、副小球藻(Parachlorella)、微绿球藻(Nannochloris)和AHP(原壁菌-卷旋孢菌-假绿藻)分支的单系性获得了强支持。小球藻和副小球藻分支形成了强支持的姐妹群，而微绿球藻分支被中等支持为小球藻+副小球藻谱系的姐妹群。

在小球藻分支内，研究揭示了重要的分类学见解。微球藻属(Micractinium)是单系的且有强支持，而小球藻属(Chlorella)是多系的，这与基于核SSU+ITS2序列的分析一致。值得注意的是，普通小球藻(Chlorella vulgaris，小球藻属的模式种)、变异小球藻(C. variabilis)和嗜热新小球藻(N. thermophila)在质体基因组系统发育中形成了一个强支持的集群(100/1.00/100)。索罗金小球藻(C. sorokiniana)和太阳虫小球藻(C. heliozoae)也构成了一个得到很好支持的支系(100/1.00/100)。

结构特征分析揭示了IR区有趣的进化模式。所有副小球藻分支的质体基因组都保留了IR区，而其姐妹群小球藻分支的大多数质体基因组则丢失了IR区，除了小球藻分支基部的一个支系。微绿球藻分支作为副小球藻和小球藻分支谱系的基部，已完全丢失了IR区。位于微绿球藻分支外部的单型分支假绿藻(P. wilhelmii)保留了IR区。相比之下，AHP分支完全丢失了IR区。结合IR区和系统发育关系表明，小球藻科至少经历了三次独立的IR区丢失事件。

比较13个质体基因组的IRa区基因内容和基因顺序发现，假绿藻(P. wilhelmii)独特地编码了额外的蛋白编码基因(accD, psaI, atpB, atpE, 和 rps4)。在副小球藻分支内，基部谱系(针形拟细线藻Closteriopsis acicularis和尖网孢藻Dictyosphaerium acuatus)仅保留了核心的rRNA/tRNA基因，而衍生的球状细胞谱系获得了补充基因(rbcL, psbA, rps14, atpA)。小球藻分支的IR区明显短于副小球藻分支。从假绿藻到副小球藻分支，再到小球藻分支，存在基因含量减少的趋势。

结构变异在小球藻科中非常普遍，甚至在种内不同菌株间也存在。对五个普通小球藻(C. vulgaris)菌株质体基因组的比较显示，倒位和逆转是常见的。结果显示四种类型的基因排列。虽然各菌株的蛋白编码基因数量保持一致，但质体基因组大小存在显著差异，从154,201 bp到176,851 bp不等。这种变异主要归因于含有有限数量开放阅读框(ORFs)的大片段和基因间区。

密码子使用偏好性分析揭示了不同生活策略类群的显著差异。58个质体基因组的编码区总GC含量在23.6%到38.3%之间。第三密码子位置(GC3)的GC含量明显较低，在7.2%到20.8%之间，表明小球藻科质体基因组偏好A/T碱基和A/T结尾的密码子。

对不同生活策略组间密码子使用偏好性的详细比较显示显著差异，特别是在专性异养类群和自养/混养物种之间。自养和混养类群在密码子使用上表现出高度相似性，主要区别在于混养类群编码异亮氨酸(Ile)时偏好AUA，编码精氨酸(Arg)时倾向于选择CGG。相比之下，专性异养类群在特定密码子的使用上与自养和混养类群相比表现出显著偏好。专性异养类群偏好使用GGA编码甘氨酸(Gly)，CAU编码组氨酸(His)，AUA编码异亮氨酸(Ile)，UUA编码亮氨酸(Leu)，AGA和AGG编码精氨酸(Arg)，UAU编码酪氨酸(Tyr)。这些发现表明，生活策略在塑造小球藻科质体基因组密码子使用模式方面起着重要作用，专性异养类群表现出独特的偏好，可能反映了对其独特代谢需求的适应。

不同生活策略的质体基因组特征分析表明，与自养和混养藻类相比，专性异养藻类经历了显著变化，包括GC含量降低和质体基因组长度显著减少。这些改变是由于基因间隔区减少和编码基因(CDS)数量减少所致。虽然混养和自养类群表现出相似的基因数量，包括与光合作用、转录和翻译相关的基因，但专性异养类群已经丢失了所有与光合作用相关的基因，以及一些与ATP合酶和RNA聚合酶相关的基因。

这项研究最终成功解析了小球藻科主要谱系间的系统发育关系，揭示了该科质体基因组普遍存在的结构变异，并发现了专性异养类群与自养和混养类群相比在质体基因组大小、基因含量和密码子使用偏好性方面的显著适应性变化。研究不仅增进了我们对小球藻科系统发育关系的理解，而且丰富了对其进化多样性的认识，为微藻资源的利用和开发提供了基础。

研究的局限性在于尽管分类覆盖度显著增加，但仍不完整，许多不常见或不可培养的类群未被包括在内，可能影响系统发育解析度。此外，质体基因组结构变异和密码子使用偏好性在异养谱系中的功能意义需要进一步的实验验证。未来的研究应扩大分类单元采样，特别是未充分研究的属，并整合多组学方法以澄清该科的系统发育和进化。与其他 Trebouxiophycean 谱系的比较研究也有助于阐明质体基因组结构的更广泛进化模式。解决这些空白将增强我们对小球藻科多样性以及生态适应基因组基础的理解。