大豆早期抗霜霉病关键通路与调控网络的转录组解析

本研究针对大豆霜霉病（SDM）严重威胁全球大豆产量与品质的问题，通过转录组测序与WGCNA分析，揭示了高抗（HR）品种"蛟河小黒豆"（JH）与高感（HS）品种"吉林5号"（JL）在接种Peronospora manshurica（Pm）后0-72小时的动态分子响应。研究发现MAPK信号通路、植物-病原互作通路和异黄酮生物合成通路在抗病过程中显著富集，鉴定出MYB、WRKY、bZIP等58个转录因子家族及6个枢纽基因参与调控。该研究为解析大豆抗霜霉病分子机制提供了新见解，为抗病育种奠定了理论基础。

　　

大豆作为全球最重要的油料和蛋白作物之一，其生产长期受到病原菌的严重威胁。其中由专性寄生菌Peronospora manshurica（Pm）引起的大豆霜霉病（Soybean Downy Mildew, SDM）是一种破坏性真菌病害，特别是在中国东北和北部地区，由于凉爽温度和高温环境，该病害发生尤为严重。Pm不仅通过风媒传播孢子侵染叶片，还能通过菌丝感染种子，实现代际传播。目前防治手段包括农业实践、化学处理和抗病品种选育，但长期使用化学药剂会导致病原菌抗性增强、环境污染以及对后茬作物的负面影响，因此培育抗病品种成为最可持续的防治策略。

尽管在模式植物拟南芥中已发现149个NBS-LRR（Nucleotide-Binding Site-Leucine-Rich Repeat）结构域蛋白，其中至少28个赋予对Peronospora parasitica的抗性（称为RPP基因），在菠菜中也发现了6个抗霜霉病（Resistance against Peronospora farinosa, RPF1-RPF6）位点，但针对大豆对Pm抗性机制的研究仍然有限。先前研究虽然通过RAPD标记鉴定了一个与SDM抗性紧密连锁的显性抗病基因（Rpmx），并通过RNA-seq分析了抗感基因型间的转录组差异，发现了52个差异表达基因（DEGs）和GmWRKY31转录因子通过结合GmSAGT1启动子W-box元件参与水杨酸（SA）介导的免疫响应，但整体分子调控网络仍不清楚。

在此背景下，研究人员在《BMC Plant Biology》发表了最新研究成果，通过整合转录组测序和加权基因共表达网络分析（WGCNA）技术，系统解析了大豆早期响应Pm侵染的关键通路和调控网络。

研究采用Illumina NovaSeq 6000平台对高抗品种JH和高感品种JL在接种Pm后0、6、12、24、48和72小时的叶片进行转录组测序，共构建36个cDNA文库。通过DESeq2进行差异表达分析，筛选条件为|log2(FoldChange)|≥1且padj<0.05；使用WGCNA构建基因共表达网络并识别关键模块；通过GO和KEGG进行功能富集分析；采用qRT-PCR验证枢纽基因表达。

接种后表型症状进展

研究人员首先评估了接种14天后两个品种的病害症状。结果显示，抗病品种JH叶片保持绿色且无可见症状，病害指数为0；而感病品种JL叶片出现明显褪绿和黄化，病害指数为100，证实JH为高抗（HR）、JL为高感（HS）。早期感染进程观察发现，0-48小时两个品种均未出现明显视觉症状，到72小时JL叶片出现轻微褪绿和变色，JH则未受影响，表明0-72小时为大豆霜霉病早期感染阶段。

RNA-Seq数据质量与基因表达分析

研究共获得227.25 Gb原始数据和223.81 Gb高质量清洁数据，各样本Q30值均高于95.43%，与参考基因组Glycine max（Williams82, v2.1）的比对效率为76.54-95.22%。FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）分布一致，生物学重复间Pearson相关系数R2>0.945，表明数据质量高且重复性好。

转录组分析揭示差异表达基因

在接种后5个时间点（vs 0h对照），JH共鉴定58,129个DEGs（26,290上调，31,839下调），JL鉴定64,963个DEGs（30,409上调，34,554下调）。JH中上调DEGs数量在6、12、24、48和72小时分别为5,481、5,137、7,779、3,122和4,771，下调基因分别为6,794、6,647、8,934、4,090和5,374。JL中相应时间点上调基因为5,649、5,776、6,343、6,734和5,907，下调基因为5,890、6,250、8,290、6,539和7,585。

转录因子分析

研究鉴定出17,677个DEGs属于58个转录因子家族，其中bHLH、MYB-related、NAC、C2H2、ERF、WRKY、C3H、FAR、B3、bZIP和MYB等11个家族各占TFs总数3%以上。特别值得注意的是，已知参与植物防御反应的MYB（1,722个）、WRKY（930个）和bZIP（626个）家族TF数量丰富，表明这些TF在大豆响应Pm感染中起关键调控作用。

抗感品种差异表达基因功能富集

KEGG富集分析发现，JH中上调DEGs显著富集于MAPK信号通路（gmx04016）、植物-病原互作（gmx04626）、昼夜节律（gmx04712）和异黄酮生物合成（gmx00943）等防御相关通路；而下调基因富集于DNA复制（gmx03030）、马达蛋白（gmx04814）、卟啉代谢（gmx00860）和生物素代谢（gmx00780）等通路。JL中上调DEGs与JH下调基因共同富集于MAPK信号通路、植物-病原互作、异黄酮生物合成、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解（gmx00280）、内吞作用（gmx04144）和过氧化物酶体（gmx04146）等通路。

MAPK信号通路基因鉴定

JH在接种后各时间点均发现MAPK通路相关基因上调（6h:89、12h:80、24h:115、48h:47、72h:75）。31个DEGs在五个时间点持续参与MAPK通路，其中25个在JH和JL中均显著上调但表达水平不同，6个在JL中一个或多个时间点下调或无显著变化。

植物-病原互作通路基因鉴定

JH中70、65、115、41和83个DEGs分别在五个时间点与植物-病原互作通路相关。18个DEGs持续参与该通路，其中11个在两种基因型中均上调但表达量不同，7个在JL中一个或多个时间点下调或无变化。Glyma.10G274400（编码3-酮脂酰-CoA合酶6）在JH接种12h后显著下调，可能通过影响酶生物合成或活性负向调控抗病性。

异黄酮生物合成通路基因鉴定

JH中异黄酮生物合成通路相关基因在五个时间点均上调（6h:11、12h:14、24h:26、48h:10、72h:19）。6个DEGs持续参与该通路，其中5个在两种基因型中均上调。Glyma.09G269600（编码双功能二氢黄酮醇4-还原酶/黄烷酮4-还原酶）在JL中48h和72h显著上调，而在早期时间点无变化，可能通过防御相关次生代谢物合成参与抗病。

WGCNA识别关键模块

使用33,255个基因构建共表达网络，软阈值β=10时 scale-free topology fit index R2>0.8。共识别24个模块，最大turquoise模块含8,017基因，最小darkturquoise模块含86基因。通过模块-性状相关性分析发现，紫色模块（113基因）与0h对照（r=0.91, p=0.00005）、暗红色模块（113基因）与6h（r=0.90, p=0.00007）和蓝色模块（4,478基因）与24h（r=0.83, p=0.00007）显著正相关，这些模块可能包含抗病相关基因。

关键模块功能富集分析

蓝色模块KEGG富集分析显示显著富集于缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解、MAPK信号通路、植物-病原互作、自噬、丙酸代谢、赖氨酸降解、β-丙氨酸代谢、泛素介导的蛋白水解、黄酮生物合成（gmx00941）和苯丙氨酸代谢（gmx00360）等通路。暗红色模块未显著富集KEGG通路。

转录组与WGCNA整合分析

整合分析发现，MAPK信号通路中7个DEGs在JH五个时间点均上调而在JL中下调或无变化。蓝色模块显著富集该通路，共同鉴定出三个关键基因：Glyma.08G083300（编码LRR受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶FLS2，作为模式识别受体PRR识别PAMP并启动免疫响应）、Glyma.07G105700（编码MAPK激酶9，MAPK信号级联关键组分）和Glyma.04G147000（编码EIN3结合F-box蛋白1，通过调节EIN3蛋白稳定性介导乙烯与MAPK信号串扰）。

植物-病原互作通路中6个DEGs在JH中持续上调而在JL中下调或无变化。蓝色模块富集该通路，鉴定出四个关键基因：FLS2（Glyma.08G083300）、Glyma.12G133700和Glyma.19G255300（编码环核苷酸门控离子通道CNGC4和CNGC1，可能通过钙信号增强免疫响应）以及Glyma.14G205600（编码PTI6，病原相关基因转录激活因子）。

转录组数据还显示JH中异黄酮生物合成通路上调DEGs显著富集，WGCNA蓝色模块显著富集黄酮生物合成和苯丙氨酸代谢通路。这三个通路均与苯丙烷代谢通路密切相关，该通路是植物重要的次生代谢通路，为多种抗病相关化合物（如木脂素、黄酮类和异黄酮类）合成提供基础，从而增强植物对病原菌的防御能力。

枢纽基因筛选与验证

从暗红色和蓝色模块中各筛选前10个枢纽基因（基于kWithin值）。暗红色模块枢纽基因包括Glyma.08G211700（磷脂酶Dα1）、Glyma.09G285100（MAP65/ASE1微管相关蛋白）、Glyma.18G064900（肽转运蛋白1）等；蓝色模块包括Glyma.01G017700（PLATZ转录因子）、Glyma.07G028600（甘油激酶）、Glyma.16G136600（编码TIR-NBS-LRR类抗病蛋白，含NB-ARC和TIR结构域）等。

通过qRT-PCR验证9个候选枢纽基因，结果与RNA-seq一致。Glyma.01G017700、Glyma.09G185900、Glyma.15G267700和Glyma.16G136600在JH接种24h后表达显著高于其他时间点和JL24h样本；Glyma.03G011000和Glyma.04G205400在JH接种6h后表达显著上调。

研究结论表明，大豆对Pm的抗性涉及多个TF家族和多样代谢通路。早期感染阶段，PRR识别PAMP启动PTI响应，涉及乙烯信号和多个TF激活；同时NLR受体识别病原效应子触发ETI。这些免疫响应伴随广泛代谢和信号变化，包括异黄酮和黄酮生物合成、苯丙氨酸代谢和植物-病原互作通路激活。钙信号和CNGC基因在防御调控中起关键作用，共同构成大豆抗Pm侵染的分子防御网络。

该研究首次整合转录组与WGCNA分析揭示大豆早期抗霜霉病的分子机制，鉴定出MAPK信号通路、植物-病原互作和苯丙烷代谢通路的核心作用，发现多个关键TF家族和枢纽基因。这些发现为解析大豆抗病分子网络提供了新见解，为抗病育种提供了候选基因和理论依据。未来需要通过基因编辑和转基因技术验证候选基因功能，结合多组学数据全面阐明抗病机制，并开展田间应用评价，为大豆抗病品种选育提供技术支持。