禾本科源病毒组装抑制剂的发现及其对马铃薯Y病毒（PVY）的防控机制研究

为解决马铃薯Y病毒（PVY）对茄科作物的严重危害问题，研究人员基于禾本科植物次生代谢物苯并恶唑烷酮结构，设计合成了一系列磺酰胺类衍生物，并发现化合物L5可通过靶向病毒衣壳蛋白（CP）的V211位点抑制病毒颗粒组装，从而有效阻断PVY的系统性感染。该研究为开发新型病毒组装抑制剂提供了先导化合物和理论依据。

　　

在全球粮食安全面临严峻挑战的背景下，马铃薯、番茄、辣椒和茄子等茄科作物作为养活了超过十亿人口的重要经济作物，其生产却持续受到马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）的严重威胁。PVY是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，能够引起系统坏死、叶片斑驳和块茎畸形等症状，导致马铃薯产量最高减少80%，且其通过蚜虫以非持久性方式快速传播，遗传可塑性高易产生重组株系，使得传统化学杀虫剂和转基因抗性等防控策略效果有限。病毒的成功系统感染和传播依赖于完整病毒颗粒的形成，因此靶向抑制衣壳蛋白（Coat Protein, CP）介导的病毒RNA包装过程有望成为破坏病毒组装的有效策略，然而目前能够干扰该过程的抑制剂报道仍非常稀缺。

近期发表于《BMC Plant Biology》的一项研究，以禾本科（Poaceae）植物中具有化感作用的次生代谢产物苯并恶唑烷酮为先导骨架，通过引入具有抗病毒活性的磺酰胺单元，采用分子杂交策略设计并合成了34个新型杂交分子（L1-L34），并系统评价了它们抗PVY的活性。研究人员进一步阐明了活性最优化合物L5通过破坏病毒组装的初步作用机制，为合理开发针对PVY及相关植物病毒的新型病毒颗粒组装抑制剂提供了有前景的先导化合物。

本研究采用半叶枯斑法测定目标化合物的抗病毒效能（包括治疗活性、保护活性和灭活活性），以藜（Chenopodium amaranticolor）作为局部枯斑寄主，利巴韦林（ribavirin）作为阳性对照。活性评估结果表明，在500 μg/mL浓度下，大多数化合物表现出良好的抗PVY活性，其中部分化合物活性优于阳性对照。进一步测定了L5、L11、L13、L21、L23和L32的灭活活性EC₅₀值，发现化合物L5的EC₅₀值最低，为169.4 μg/mL，低于阳性对照利巴韦林（244.7 μg/mL）。初步构效关系分析表明，R₁为苯基取代时活性优于脂肪族取代（L31 > L27, L29；L32 > L28, L30），且苯环上甲基取代比卤素取代更有利于抗病毒活性（L4 > L9, L16, L19）。

为探究L5的作用机制，研究人员通过分子对接和分子动力学模拟分析了L5与PVY CP（PDB ID: 6HXX）的相互作用，发现L5与PVY CP的结合能为-6.61 kcal/mol，其中Val211（V211）与L5形成1.8 ?的氢键，Lys153形成3.1 ?的氢键，同时与Pro154（2.6 ?）和Asp192（2.4 ?）产生离子相互作用，并与Pro179和Arg208存在疏水接触。分子动力学模拟（10,000 ps）显示复合物结构稳定，RMSD波动较小，表明V211是L5结合的关键残基。

为验证V211是L5作用于PVY CP的关键氨基酸残基，采用生物层干涉技术（Bio-Layer Interferometry, BLI）测定了L5与PVY CP^WT和PVY CP^V211A（V211位点突变为丙氨酸）的结合强度。结果显示，L5与PVY CP^WT具有较强的亲和力，K_d值为13.6 μM；而与PVY CP^{V211A的相互作用亲和力显著减弱，K_d值为396.8 μM，相差29.8倍，表明V211位点的突变显著削弱了L5与PVY CP的结合强度。}

为在体内验证V211作为L5作用靶点的功能，研究人员构建了含绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的PVY感染性克隆pCamPVY-GFP，并通过位点定向诱变技术获得了pCamPVY^V211A-GFP突变体。将两种构建体转化至农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101后浸润本氏烟（Nicotiana benthamiana），在接种后7天（7 dpi），野生型PVY-GFP感染的系统叶片表现出强烈的GFP信号，而V211A突变体感染的植株仅显示背景荧光。Western blot和RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链反应）分析进一步证实，野生型感染中PVY CP积累丰富，而V211A突变体中病毒积累量极低，表明V211突变严重损害了病毒的积累能力。

为研究PVY CP V211位点对病毒细胞间移动的影响，将携带PVY-GFP或PVY^V211A-GFP的农杆菌悬浮液（OD₆₀₀ = 0.0005）浸润本氏烟叶片，在5 dpi通过共聚焦显微镜观察荧光信号。结果显示，PVY^V211A-GFP仍呈现扩散的荧光模式，表明V211替换并未损害病毒的细胞间移动能力，说明该突变不影响病毒在体细胞组织中的短距离传播，病毒侵染性得以保留。

病毒颗粒组装是病毒在宿主细胞内感染的最后阶段，PVY的衣壳蛋白通过自身相互作用或与正链RNA（(+)ssRNA）结合介导这一过程。为评估V211在PVY组装中的作用，研究人员将野生型PVY-GFP和突变型PVY^V211A-GFP通过农杆菌浸润法导入本氏烟成熟叶片，随后提取纯化病毒颗粒，经1%磷钨酸负染后通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM）观察。TEM分析显示，PVY^V211A-GFP病毒颗粒的长度显著短于野生型PVY颗粒，表明V211是PVY CP中调控正确病毒组装的关键残基。

本研究成功开发了源自禾本科植物次生代谢物的苯并恶唑烷酮类化合物L5，其在灭活试验中表现出优于商品化对照药剂利巴韦林的抗PVY活性。分子对接、动力学模拟和生物层干涉技术鉴定出V211为L5结合的关键位点，V211A突变体病毒在系统感染中荧光强度显著减弱，但病毒细胞间移动未受损害，同时病毒颗粒数量和长度均显著减少，表明L5通过干扰CP介导的病毒RNA组装而非病毒移动过程发挥抗病毒作用。这些结果确立了L5作为合理设计依赖CP的病毒颗粒组装抑制剂的有前景先导化合物，为通过靶向破坏病毒包装机制防控PVY及相关植物病毒提供了战略框架。

研究过程中运用的主要关键技术方法包括：基于半叶枯斑法的抗病毒活性评价体系；分子对接与分子动力学模拟分析化合物与靶标蛋白的相互作用；生物层干涉技术（BLI）定量测定小分子与蛋白的结合亲和力；农杆菌介导的植物瞬时转化技术用于体内病毒侵染性研究；以及透射电子显微镜（TEM）负染技术观察病毒颗粒形态。本氏烟（Nicotiana benthamiana）和藜（Chenopodium amaranticolor）由贵州大学绿色农药全国重点实验室提供。