长链非编码RNA样MMP14 RNA通过抑制STARD13启动子区H3K27cr促进结直肠癌转移的机制研究

本研究针对MMP14蛋白靶向治疗失败的问题，创新性发现MMP14 RNA具有lncRNA样功能。研究人员通过多组学分析证实MMP14 RNA通过招募SIRT3至STARD13启动子区域，降低H3K27cr水平从而抑制STARD13转录，最终驱动结直肠癌转移。该研究为核酸药物治疗肿瘤提供了新靶点，对改善晚期结直肠癌治疗策略具有重要意义。

　　

在当今全球癌症负担中，结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）已成为导致癌症相关发病率和死亡率的主要因素之一。虽然早期结直肠癌可以通过手术和辅助治疗有效处理，但晚期转移阶段仍然临床难以应对，患者五年生存率低于15%。癌症转移是一个复杂的多步骤过程，涉及肿瘤细胞脱离、血管内渗、免疫逃逸、实质外渗以及在远处器官的定植。尽管上皮-间质转化（EMT）、肿瘤细胞可塑性和细胞外基质蛋白水解等机制与结直肠癌转移有关，但转移的关键分子驱动因素仍知之甚少，这阻碍了有效治疗策略的开发。

基质金属蛋白酶14（Matrix Metalloproteinase 14, MMP14）被公认为促侵袭和促肿瘤生成基因。MMP14蛋白通过多种机制促进癌细胞的侵袭性，包括降解细胞外基质、形成侵袭伪足、蛋白酶脱落以及调节整合素和转移相关基因的表达。此外，MMP14蛋白还通过抑制细胞毒性T细胞浸润、促进结缔组织增殖和促进肿瘤血管化来影响肿瘤微环境，所有这些都有助于癌症进展。鉴于其在肿瘤发展中的关键作用，MMP14蛋白已成为一个有前景的治疗干预靶点。然而，迄今为止，尚无专门针对MMP14蛋白的药理学药物在临床肿瘤学中成功应用。有证据表明，即使是MMP14 RNA的小片段，例如由细胞质尾部缺失、E240A活性位点突变和弗林蛋白酶切割位点突变产生的片段，也可以促进癌症转移。这引发了一个新问题：MMP14 RNA是否独立于其蛋白质功能促进肿瘤进展。

目前尚无报道表明MMP14 RNA独立于其蛋白质功能促进肿瘤进展。本研究揭示了MMP14 RNA在促进结直肠癌转移中扮演关键角色。机制上，MMP14 RNA招募SIRT3到STARD13启动子，导致H3K27cr去除，从而抑制STARD13表达并最终增强结直肠癌转移。此外，与抑制MMP14蛋白相比，沉默MMP14 RNA对肿瘤转移的抑制效果更为显著。这些发现表明，MMP14 RNA作为结直肠癌转移的关键调节因子，其功能独立于蛋白质角色。

该研究由徐州医科大学病理学系的李梦婷等人完成，论文发表在《Cellular & Molecular Biology Letters》期刊上。研究人员通过多种技术方法开展研究，包括利用功能丧失和功能获得方法进行Transwell实验和动物实验，以评估MMP14 RNA在促进结直肠癌转移中的作用；结合免疫沉淀实验、单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析和Western blotting来阐明MMP14 RNA促进转移的潜在机制；此外还采用了染色质免疫沉淀（ChIP）、RNA免疫沉淀（RIP）、荧光原位杂交（FISH）等关键技术。样本来源包括人类结直肠癌细胞系（如DLD-1、HCT116、LoVo等）和临床组织样本。

MMP14基因同义突变与死亡率和远处转移相关

为了探究结直肠癌转移的驱动因素，研究进行了多队列比较分析，揭示了42个在远处转移性和原发性结直肠癌组织之间差异表达的基因。生存分析识别出8个具有预后意义的基因，单细胞转录组分析显示MMP14在结直肠癌组织来源的上皮细胞中显著上调。qRT-PCR分析证实MMP14在结直肠癌组织中表达显著升高。值得注意的是，约70%的MMP14突变携带者为同义突变，其频率远高于其他前20突变基因。MMP14同义变异与更高的死亡率和远处转移率相关，表明MMP14 RNA介导了结直肠癌转移。

MMP14 RNA促进结直肠癌细胞侵袭和迁移

研究人员构建了两种MMP14表达质粒：蛋白质编码质粒和RNA特异性质粒（突变起始密码子）。瞬时转染任一构建体均显著增强侵袭和迁移水平。稳定表达MMP14 RNA显示出促转移效应，而抑制MMP14 RNA则产生相反效果。通过Cas9介导的MMP14蛋白敲除（保留RNA表达）结合siMMP14处理，进一步证实了RNA驱动的转移潜力。免疫印迹分析显示，过表达MMP14 RNA下调E-钙黏蛋白（E-Cadherin），上调N-钙黏蛋白（N-Cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和Snail1，而MMP14 RNA沉默则呈现相反趋势。这些数据共同证明MMP14 RNA促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移。

MMP14 RNA通过抑制STARD13促进细胞侵袭和迁移

为了研究MMP14 RNA的促侵袭机制，研究人员鉴定了18个受MMP14 RNA调控的下游基因。其中，STARD13（一种Rho GTP酶激活蛋白（GAP）和肿瘤抑制基因）与MMP14 RNA水平呈显著负相关。qRT-PCR证实STARD13在结直肠癌组织中显著下调。MMP14 RNA过表达降低了STARD13的RNA和蛋白质水平，而MMP14沉默则增加了其表达。将STARD13质粒瞬时转染到MMP14 RNA稳定表达的细胞中，成功通过恢复E-钙黏蛋白和Snail1的表达，挽救了侵袭和迁移水平。这些数据表明MMP14 RNA通过抑制STARD13驱动侵袭和迁移。

MMP14 RNA抑制STARD13启动子的转录活性

亚细胞定位分析显示部分MMP14 RNA在细胞核中积累，这为其抑制STARD13表达的机制提供了线索。LongTarget预测MMP14 RNA与STARD13启动子结合，ChIRP实验进一步验证了MMP14探针在STARD13启动子上的显著富集。荧光素酶报告实验显示，转染MMP14-ATGmut质粒的结直肠癌细胞中STARD13启动子活性降低，而MMP14沉默则增强了活性。这些观察表明MMP14 RNA结合STARD13启动子并抑制其转录活性。

MMP14 RNA减少STARD13启动子上的H3K27cr占据

基因集富集分析（GSEA）显示MMP14 RNA表达与H3K27cr富集的启动子相关。RIP实验证明H3K27cr与MMP14 RNA显著相互作用。进一步研究发现，克罗康酸二钠盐（NaCr）可以挽救被MMP14 RNA抑制的STARD13表达。ChIP-PCR分析显示，在HCT116细胞中转染MMP14-ATGmut质粒会损害STARD13启动子上的H3K27cr富集，表明MMP14 RNA通过H3K27cr抑制STARD13表达。ChIP-seq分析鉴定了多个差异峰，其中20.15%的差异峰位于启动子区域，对应622个基因。KEGG富集分析显示这些基因显著富集于转移相关通路（如粘着斑和粘附连接）。这些基因在远处转移部位显著富集，且主要与上皮细胞相关。Metascape分析发现RHO GTP酶循环通路富集，该通路在远处转移部位显著富集。单细胞转录组分析显示RHO GTP酶循环通路在肝转移（LM）来源的上皮细胞中富集。这些发现表明MMP14 RNA通过H3K27cr介导的RHO GTP酶循环通路调节结直肠癌转移。

MMP14 RNA通过与SIRT3结合调节STARD13启动子上的H3K27cr占据

为了研究MMP14 RNA如何调节STARD13启动子上的H3K27cr占据，研究人员聚焦于克罗托尼基转移酶和去克罗托尼基酶。RIP实验显示SIRT3与MMP14 RNA的关联最强。RNA-FISH证明SIRT3蛋白与MMP14 RNA在细胞核中共定位。结构域分析显示SIRT3的N端区域与MMP14 RNA相互作用。ChIP-seq分析在转染MMP14-ATGmut的HCT116细胞中鉴定出1652个上调和21个下调的SIRT3结合峰。其中14.52%的差异峰位于启动子区域，对应240个基因，这些基因在远处转移性结直肠癌组织中显著富集。这240个基因表现出对LM来源的上皮细胞、Tex和Treg群体的细胞类型特异性，通路分析显示RHOA GTP酶循环是最富集的信号通路。在240个基因子集中，有8个基因的启动子上的H3K27cr水平显示依赖调节。在STARD13启动子上，MMP14 RNA过表达引发SIRT3招募并伴随H3K27cr减少，ChIP-PCR实验进一步证明了MMP14 RNA介导的SIRT3在该位点的富集。在HCT116细胞中共转染MMP14-ATG和siSIRT3的挽救实验显示，SIRT3敲除挽救了MMP14 RNA介导的STARD13抑制。这些发现表明MMP14 RNA通过与SIRT3结合并促进其招募到STARD13启动子区域来调节H3K27cr占据。

MMP14 RNA在体内促进结直肠癌转移

研究人员在体内研究了MMP14 RNA的促转移功能。结果显示MMP14 RNA过表达促进肺转移结节形成，并伴随肺重量和转移面积的增加。分子分析显示MMP14 RNA介导的E-钙黏蛋白和STARD13下调。比较抑制MMP14 RNA和MMP14蛋白对细胞侵袭的影响，发现抑制MMP14 RNA效果更佳。这些发现表明MMP14 RNA在体内促进结直肠癌转移，针对MMP14 RNA的核酸药物治疗可能比传统蛋白抑制剂提供更大的抗肿瘤疗效。

研究结论与讨论部分强调，该研究揭示了一种非经典的、长链非编码RNA样（lncRNA-like）的MMP14 RNA在结直肠癌转移中的作用机制，该机制不同于其蛋白质的蛋白酶活性。临床数据分析显示MMP14 RNA过表达与结直肠癌不良预后相关，并驱动转移。机制上，MMP14 RNA与SIRT3相互作用，促进SIRT3招募到STARD13启动子，降低H3K27cr水平并抑制STARD13表达，最终促进结直肠癌转移进程。这种RNA驱动机制可能解释了MMP14抑制剂在减轻肿瘤负荷或提高患者生存率方面效果有限的原因。研究证明RNA沉默MMP14比蛋白质抑制更能有效抑制肿瘤转移，特别是在MMP14 RNA过表达条件下，表明蛋白质水平的单一治疗可能不足以阻止肿瘤进展。未来，针对MMP14 RNA的核酸药物治疗可能提供更大的抗肿瘤功效。

该研究还探讨了同义突变的生物学意义。同义突变长期以来被认为是不改变蛋白质序列的“中性突变”，但最近研究表明大多数同义突变可能是有害的。在癌症中，同义突变经常作为驱动突变，其替换在癌基因中显著富集。这些突变虽然不改变编码的氨基酸，但可以影响基因表达， impact RNA稳定性、折叠和剪接，从而影响mRNA翻译的速度或准确性。此外，lncRNA中的突变与肿瘤发生和进展相关。这种现象可能归因于这些突变改变RNA二级结构，从而影响蛋白质与RNA的结合亲和力。尽管MMP14表达与预后的关联已得到广泛验证，但其体细胞突变与临床结果之间的关联仍未充分探索，可能是因为MMP14在肿瘤中的突变频率较低。本研究发现在MMP14基因中的同义突变与死亡率和远处转移增加显著相关。研究人员提出这些同义突变可能改变MMP14 RNA的二级结构，从而改变其与SIRT3的相互作用，最终通过H3K27cr/STARD13通路影响转移。mRNA的lncRNA样行为可能为同义突变的有害效应提供新解释。

此外，研究还讨论了H3K27cr在肿瘤抑制基因（TSG）中的作用。之前的研究表明H3K27cr在结直肠癌组织中升高，并作为癌基因（如ETS1）启动子上的转录激活标记来激活癌基因转录。然而，其在肿瘤抑制基因中的作用仍不清楚。本研究揭示了H3K27cr富集在TSG启动子（如STARD13）上减少并抑制基因表达，这与H3K27cr在活性基因启动子上积累的观点一致。维持H3K27cr空间平衡的机制——在癌基因上升高与在TSG上降低——仍不明确。该研究揭示了一个空间精确的调节轴：MMP14 RNA作为支架招募SIRT3到STARD13启动子，催化局部H3K27cr去除，以动态调节结直肠癌中TSG的转录。

总之，MMP14 RNA在结直肠癌组织中高表达，与侵袭性转移和不良临床结果相关。MMP14 RNA通过一种非经典的lncRNA样机制运作，通过招募SIRT3来调节染色质重塑，降低STARD13启动子上的H3K27cr水平，随后抑制STARD13表达并驱动恶性进展。这些发现阐明了MMP14 RNA在癌症进展中的新型lncRNA样功能，可能带来新的癌症治疗策略。