PDK4驱动乳酸蓄积通过LPCAT2-K375乳酸化促进STAT1/SLC7A11轴介导的铁死亡加剧脓毒症急性肺损伤

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：PDK4-driven lactate accumulation facilitates LPCAT2 lactylation to exacerbate sepsis-induced acute lung injury

本研究聚焦脓毒症诱导的急性肺损伤（SI-ALI）中代谢重编程与细胞死亡的新机制。研究人员发现，肺组织中PDK4表达上调驱动糖酵解重编程和乳酸蓄积，进而通过氨酰-tRNA合成酶1（AARS1）催化溶酶体磷脂酰胆碱酰基转移酶2（LPCAT2）第375位赖氨酸（K375）发生乳酸化修饰。LPCAT2-K375乳酸化抑制其乙酰转移酶活性，降低STAT1乙酰化并促进其磷酸化及核转位，进而转录抑制SLC7A11表达，最终诱发肺泡上皮细胞铁死亡。靶向抑制PDK4或突变LPCAT2-K375位点可有效缓解SI-ALI。该研究揭示了代谢异常、蛋白质翻译后修饰与铁死亡之间的新型交叉对话，为SI-ALI提供了潜在治疗靶点。

　　

脓毒症，这一危及生命的器官功能障碍综合征，至今仍是重症监护室内导致患者死亡的主要原因。其中，肺部是最易受累且最常发生衰竭的器官，由此引发的脓毒症诱导的急性肺损伤（SI-ALI）病情凶险，死亡率高，给患者家庭和社会医疗资源带来沉重负担。在脓毒症病理过程中，组织细胞代谢会发生深刻改变，其中，肺组织糖酵解水平显著升高，导致乳酸大量堆积。传统上，乳酸被视为组织缺氧和无氧代谢的标记物，其血浆水平与SI-ALI的严重程度和死亡率正相关。然而，乳酸本身是否主动参与了肺损伤的进程，特别是它如何损伤作为肺部重要屏障的肺泡上皮细胞，其背后的分子机制一直笼罩在迷雾之中。

近年来，一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡方式——铁死亡（Ferroptosis），被证实是SI-ALI的关键推动因素。同时，乳酸作为一种重要的信号分子，其驱动的蛋白质乳酸化（Lactylation）修饰作为一种新兴的翻译后修饰（PTM），开始在基因表达和代谢调控中展现作用。但乳酸是否通过调控非组蛋白的乳酸化来影响铁死亡，从而加剧SI-ALI，仍是一个悬而未决的科学问题。为了解决这些难题，由 Deng Yifan、Qiu Yuetan、Li Xiang 等研究人员组成团队，在《Cell Death and Differentiation》期刊上发表了他们的最新研究成果。

为了深入探索SI-ALI的发病机制，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究队列包括符合Sepsis-3标准的脓毒症患者和健康对照者，并建立了经典的小鼠盲肠结扎穿孔（CLP）模型来模拟人类SI-ALI。在细胞层面，使用了人支气管上皮细胞BEAS-2B和小鼠肺泡II型上皮细胞MLE12作为研究模型。技术手段涵盖蛋白质组学和乳酸化修饰组学分析，以筛选差异表达蛋白和乳酸化修饰位点；免疫共沉淀（Co-IP）结合蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光技术用于验证蛋白质相互作用、修饰水平及亚细胞定位；通过小干扰RNA（siRNA）敲低、质粒过表达和位点定向突变（如LPCAT2-K375R）等技术进行功能获得和缺失研究；利用染色质免疫共沉淀（ChIP）实验分析转录因子与DNA启动子的结合；采用Seahorse能量代谢分析系统检测细胞糖酵解和线粒体呼吸功能；并通过检测谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）水平以及透射电子显微镜（TEM）观察线粒体形态来评估铁死亡。

Lactate can aggravate SI-ALI

临床数据分析显示，SI-ALI患者血浆乳酸水平显著高于健康对照，且乳酸水平与炎症因子（IL-1β, IL-6, TNF-α）浓度呈正相关，与动脉血氧分压（PaO₂）/吸入氧浓度（FiO₂）比值呈负相关。在CLP模型小鼠中，也观察到类似现象。使用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）降低乳酸生成后，能有效减轻CLP小鼠的肺部炎症、降低肺湿重/干重（W/D）比值和肺损伤评分，表明乳酸积聚加剧了SI-ALI。

PDK4-dependent glycolytic reprogramming promotes lactate accumulation in SI-ALI

通过蛋白质组学分析，研究人员发现丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）在SI-ALI肺组织中表达显著上调。PDK4通过抑制丙酮酸脱氢酶（PDH）的活性，阻碍丙酮酸进入三羧酸（TCA）循环，从而促使丙酮酸转向乳酸生成。使用PDK4抑制剂（PDK4-in）处理CLP小鼠，可显著提高生存率，降低肺组织乳酸含量、PDK4表达水平、肺W/D比值和肺损伤评分。在BEAS-2B细胞中，脂多糖（LPS）刺激可上调PDK4表达并增加乳酸生成，而PDK4-in处理能逆转这一效应，恢复ATP水平，并部分纠正LPS引起的糖酵解增强和线粒体呼吸抑制。

LPCAT2-K375 lactylation may play an important role in the pathogenesis of SI-ALI

为了探究乳酸的具体作用机制，研究人员对SI-ALI肺组织进行了乳酸化修饰组学（lactylome）测序，鉴定出911个乳酸化修饰蛋白，涉及283个上调位点和807个下调位点。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，这些修饰显著富集于铁死亡相关通路。其中，溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶2（LPCAT2）的第375位赖氨酸（K375）的乳酸化修饰水平在SI-ALI中显著上调，且该位点在多种物种中保守。

The level of LPCAT2-K375 lactylation is significantly increased in SI-ALI

蛋白质印迹和免疫共沉淀实验证实，SI-ALI肺组织以及乳酸处理的BEAS-2B细胞中，总乳酸化修饰和LPCAT2-K375的特异性乳酸化水平均显著升高。免疫荧光染色进一步验证了LPCAT2-K375在SI-ALI肺组织和乳酸刺激的细胞中表达增加。

Lactate aggravates ferroptosis in epithelial cells by suppressing SLC7A11

研究发现，乳酸处理或CLP模型会下调胱氨酸/谷氨酸反向转运体（SLC7A11）的表达，而PDK4-in处理可以逆转此效应。同时，乳酸或LPS刺激会导致线粒体形态异常（如嵴减少、膜破裂）、脂质过氧化物（如MDA）和ROS水平升高、以及抗氧化剂GSH水平降低，这些都是铁死亡的典型特征。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）或UAMC-3203能够改善细胞活力，减轻肺损伤。这表明乳酸通过抑制SLC7A11表达促进了上皮细胞铁死亡。

LPCAT2-K375 mutation suppresses ferroptosis in epithelial cells by suppressing SLC7A11

为了直接验证LPCAT2-K375乳酸化的功能，研究人员构建了LPCAT2-K375R（赖氨酸突变为精氨酸，模拟去乳酸化）突变体。在BEAS-2B细胞中，与表达野生型LPCAT2（WT）的细胞相比，表达LPCAT2-K375R突变体的细胞在乳酸刺激下，其LPCAT2-K375乳酸化水平显著降低，细胞活力增强，SLC7A11表达上调，同时MDA和ROS水平下降，GSH水平升高。这表明突变LPCAT2-K375位点可以抑制乳酸诱导的铁死亡。

LPCAT2-K375 transcriptionally represses SLC7A11 by promoting STAT1 phosphorylation and nuclear translocation

机制探索方面，免疫共沉淀-质谱联用（IP-MS/MS）和分子对接分析发现LPCAT2与信号转导与转录激活因子1（STAT1）存在相互作用。STAT1是SLC7A11的已知转录抑制因子。研究发现，乳酸化修饰后的LPCAT2其乙酰转移酶活性受到抑制，导致STAT1的乙酰化水平降低，而乙酰化与磷酸化存在竞争性抑制，从而促进了STAT1在酪氨酸701位点（Y701）的磷酸化。磷酸化的STAT1（p-STAT1）随后发生核转位。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验证实了p-STAT1与SLC7A11启动子的结合。此外，使用STAT1磷酸化特异性抑制剂Fludarabine处理，可以恢复SLC7A11的表达。这些结果说明LPCAT2-K375乳酸化通过促进STAT1磷酸化来转录抑制SLC7A11。

AARS1/HDAC9 is the lactyltransferase/delactylase of LPCAT2-K375

研究人员进一步探寻了调控LPCAT2-K375乳酸化的酶。IP-MS/MS鉴定出氨酰-tRNA合成酶1（AARS1）和组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）可能是关键的修饰酶。Co-IP实验验证了LPCAT2与AARS1及HDAC9的直接相互作用。功能实验表明，在SI-ALI中表达上调的AARS1是LPCAT2-K375的乳酸转移酶（lactyltransferase），其敲低可降低LPCAT2-K375乳酸化水平；而过表达AARS1则通过LPCAT2-K375乳酸化途径影响SLC7A11表达。相反，在SI-ALI中表达下调的HDAC9则扮演去乳酸化酶（delactylase）的角色，其敲低会上调LPCAT2-K375乳酸化，而过表达则降低该修饰水平。

综上所述，本研究系统阐明了SI-ALI中一条全新的致病通路：脓毒症应激下，肺组织PDK4表达上调，驱动糖酵解重编程，导致乳酸过量积聚。高乳酸环境通过AARS1催化LPCAT2蛋白K375位点发生乳酸化修饰，而HDAC9的表达下调削弱了去乳酸化过程，进一步加剧了此修饰。LPCAT2的乳酸化抑制了其自身的乙酰转移酶活性，减少了下游转录因子STAT1的乙酰化，进而促进STAT1磷酸化及核转位。入核的p-STAT1作为转录抑制因子，抑制了SLC7A11的转录表达。SLC7A11是细胞抗氧化防御的关键组分，其下调导致谷胱甘肽合成受阻，脂质过氧化积累，最终诱发肺泡上皮细胞铁死亡，加剧肺损伤。研究结论强调，靶向抑制PDK4活性或干预LPCAT2-K375的乳酸化修饰，能够有效阻断这一信号轴，缓解SI-ALI的进程。

这项研究的重大意义在于，它首次揭示了PDK4驱动的乳酸代谢在SI-ALI中的核心地位，并创新性地提出了LPCAT2这一非组蛋白的乳酸化修饰通过STAT1/SLC7A11轴调控铁死亡的新机制，深化了对代谢重编程、蛋白质翻译后修饰和程序性细胞死亡三者之间复杂相互作用的理解。这不仅为SI-ALI的发病机制提供了全新的理论视角，更重要的是，将PDK4和LPCAT2乳酸化确立为潜在的治疗靶点，为开发针对脓毒症相关器官损伤的新型干预策略奠定了坚实的科学基础。