基于PCR-RFLP技术的甘草市场种子快速鉴定新方法开发及其遗传纯度评估

本研究针对甘草药材市场种子来源混乱、物种误标严重的问题，开发了一种低成本、快速的PCR-RFLP分子鉴定技术。通过ITS区域酶切分析，研究人员发现市售190粒"甘草"种子中仅4粒为纯正Glycyrrhiza uralensis，绝大多数为G. glabra、G. inflata及其杂交种。该技术为甘草种质资源鉴定、保障药材质量稳定提供了关键技术支撑。

在全球传统医药体系中，甘草始终占据着不可替代的地位。这种被誉为"百药之王"的草本植物，以其抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、保肝和神经保护等多重药理活性，成为日本汉方药中应用最广泛的药材——在294种非处方汉方制剂中，甘草的出现频率高达72.8%。然而令人担忧的是，日本消费的甘草绝大部分依赖从中国进口，近年来中国的出口限制政策使得甘草的稳定供应面临严峻挑战。

更棘手的是，甘草属植物存在严重的物种混淆问题。根据《日本药典》第十八版规定，仅Glycyrrhiza uralensis（甘草）和Glycyrrhiza glabra（光果甘草）被列为法定基原植物，其中甘草更是传统药用价值最高的物种。然而在实际流通领域，Glycyrrhiza inflata（胀果甘草）及其杂交种常常混入市场。这三种物种不仅形态特征相似，更因染色体数目相同（2n=16）且缺乏生殖隔离，在自然条件下极易发生杂交，导致种子资源混杂不堪。传统的形态学鉴定方法在杂交个体面前显得力不从心，而基于特异性成分（甘草香豆素、光甘草定、甘草查尔酮A）的化学分析方法又因成分含量变异大而可靠性不足。

面对这一困境，熊本大学自然科学研究中心的西田智代、泽慎一郎和杉村浩司研究团队在《Journal of Natural Medicines》发表了创新性研究成果。研究人员开发了一种基于PCR-RFLP（聚合酶链反应-限制性片段长度多态性）技术的快速鉴定方法，通过对核糖体ITS1-5.8S-ITS2区域进行酶切分析，成功实现了甘草物种的准确、低成本鉴定。

研究团队采用了多项关键技术：从市售三家供应商（C1、C2、C3）获取标称为"甘草"的种子进行形态测量和发芽实验；使用CTAB法提取DNA并对ITS区域进行PCR扩增和Sanger测序；利用NEBcutter软件筛选特异性限制性内切酶（NaeI和SfaNI）；通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切片段模式；同时辅以HPLC（高效液相色谱）分析物种特异性酚类化合物（光甘草定、甘草查尔酮A、甘草香豆素）以验证分子鉴定结果。

种子形态与发芽特性分析

研究人员首先对三家供应商的种子进行了系统测量。统计数据显示，C1供应商的种子长度（2.959±0.252 mm）、宽度（2.322±0.180 mm）和百粒重（0.937±0.026 g）均显著大于C2供应商（p<0.01）。发芽实验结果显示，经过60°C热水处理后，C1和C2种子的发芽率分别为56.5%和52.0%，而C3种子发芽率仅为6.9%，表明不同来源的种子质量存在显著差异。

生长特性与化学特征

对生长一年的植株进行表型观察发现，C1来源植株表现为斜生生长习性，卵形小叶，波状叶缘，尖端急尖，这些特征与G. inflata的形态描述一致。而C2来源植株则表现为直立生长，长圆形小叶，平直叶缘，尖端微凹，更符合G. glabra的特征。HPLC分析进一步证实了这些发现：C1种群76个个体中，48个仅检测到甘草查尔酮A（G. inflata特异性成分），12个仅检测到甘草香豆素（G. uralensis特异性成分），1个同时含有两种成分，15个未检测到任何特异性成分。相反，C2种群的三个个体均含有光甘草定（G. glabra特异性成分），其中一个还同时含有甘草查尔酮A，但未检测到甘草香豆素。

ITS序列多态性分析

通过对8个发芽个体的ITS区域进行测序，研究人员发现了两个单倍型：单倍型A（C、TGC）为G. uralensis特有，单倍型B（T、CAA）为G. glabra和G. inflata共有。基因型分析显示，50%的样本为杂合型，37.5%为纯合单倍型B，仅12.5%（1个样本）为纯合单倍型A（真正的甘草）。这一结果首次揭示了日本市售甘草种子中存在严重的物种误标和杂交现象。

PCR-RFLP鉴定体系的建立

基于发现的单核苷酸多态性（SNP），研究团队成功开发了双酶切鉴定体系。NaeI酶切位点（GCC↓GGC）仅在单倍型A中存在，酶切后产生242 bp和487 bp片段；SfaNI酶切位点（GCATC(N)5↓）在单倍型B中有三个切割位点，在单倍型A中有四个切割位点。通过两种酶的组合使用，研究人员能够清晰区分纯合G. uralensis、纯合G. glabra/G. inflata以及各种杂交类型。值得注意的是，部分样本还显示出与Glycyrrhiza aspera等其他物种杂交的特征，这表明种子污染问题比预期的更为复杂。

市场种子基因型调查

应用新开发的PCR-RFLP技术，研究人员对C1供应商的190粒种子进行了大规模基因分型。结果令人震惊：仅4粒（2.1%）为纯合G. uralensis，59粒（31.1%）为纯合G. glabra/G. inflata，127粒（66.8%）为杂合型。这些杂合个体中还包括了与G. aspera等其他甘草属物种的杂交后代。

这项研究的结论明确指出了日本市售甘草种子存在的严重物种混淆问题，并成功建立了一种低成本、快速的PCR-RFLP鉴定技术。该技术仅需使用普通PCR仪和电泳装置即可完成，无需昂贵的DNA测序仪，特别适合大规模种质资源筛查。研究发现市售所谓"甘草"种子中绝大多数实际为其他物种或杂交种，这一发现对保障甘草药材质量、推进日本国内甘草规范化种植具有重大意义。新开发的鉴定方法不仅能够准确识别纯正甘草，还能检测杂交个体，为甘草种质资源保护、新品种选育和药材质量管控提供了可靠的技术支撑，对确保甘草药材的稳定供应和品质一致性将产生深远影响。