鸡感染高致病性禽流感（H5N1）的代谢组学分析及潜在生物标志物鉴定

本研究通过非靶向代谢组学技术（LC-MS/MS）首次系统描绘了HPAI H5N1感染鸡模型的代谢扰动图谱，在肺组织和血清中分别鉴定出44和37种显著差异代谢物，揭示了鞘脂代谢（Sphingolipid Metabolism）和色氨酸代谢（Tryptophan Metabolism）等关键通路的激活，为理解病毒致病机制及开发新型诊断策略提供了重要依据。

　　

引言

高致病性禽流感病毒（HPAI）H5N1是一种重要的人畜共患病原体，对家禽业和公共卫生构成严重威胁。其高致死率和近期宿主范围的扩大，使得解析其致病分子机制成为当务之急。代谢组学作为研究生物体内小分子代谢物的系统性科学，能够实时反映表型变化，为揭示宿主-病原体相互作用提供了独特视角。尽管已有研究利用小鼠和雪貂模型对流感病毒进行代谢组学分析，但针对H5N1在鸡这一天然宿主中的代谢响应研究尚属空白。本研究首次对HPAI H5N1感染鸡开展全面的代谢组学分析，旨在揭示感染相关的代谢重编程并识别潜在生物标志物。

材料与方法

实验使用六周龄SPF鸡，分为感染组和对照组。感染组通过鼻内接种10⁶ EID₅₀的H5N1病毒株（A/duck/India/02CA10/2011/Agartala），对照组接种PBS缓冲液。在接种后12小时收集血清和肺组织样本。样本采用三重溶剂（乙腈:甲醇:水=2:2:1）进行前处理以灭活病毒，并通过鸡胚接种试验验证灭活效果。

代谢物提取严格遵循标准化流程：肺组织经液氮研磨后加入提取溶剂，血清样本直接与溶剂混合，经超声处理、离心和真空干燥后重建于0.1%甲酸溶液。代谢组学分析采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统（QTRAP 6500质谱仪耦合Agilent 1290 Infinity II液相系统），在正负离子模式下进行数据采集。原始数据经MZMine 2.53软件进行峰对齐、去同位素和代谢物鉴定，使用MS2Compound工具匹配人类代谢组数据库（HMDB）。统计分析和通路富集通过MetaboAnalyst 6.0完成，采用PCA和OPLS-DA模型评估组间差异，并通过ROC曲线分析筛选生物标志物。

结果

肺组织代谢谱分析

肺组织代谢组学分析在正离子模式和负离子模式下分别识别出31和13个显著差异代谢物。OPLS-DA模型显示感染组与对照组明显分离（正离子模式Q²=0.645，负离子模式Q²=0.646）。显著上调的代谢物包括鞘氨醇（Sphingosine）、硫酸脑苷脂（Psychosine sulfate）、吲哚乙醛（Indoleacetaldehyde）和11,14,15-三羟基二十碳三烯酸（11,14,15-THETA）等。通路富集分析显示鞘脂代谢和色氨酸代谢通路显著激活（p<0.05）。

血清代谢谱分析

血清分析鉴定出22个（正离子模式）和15个（负离子模式）显著差异代谢物。关键变化包括2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）、喹啉酸（Quinolinic acid）、L-丝氨酸（L-Serine）和L-脯氨酸（L-Proline）的上调。富集通路分析显示精氨酸和脯氨酸代谢、雌激素代谢及烟酸盐代谢通路显著改变（p<0.05）。

生物标志物鉴定

通过ROC曲线分析，肺组织中鞘氨醇（AUC=0.84）、磷脂酰丝氨酸PS(16:1(9Z)/16:1(9Z))（AUC=0.901）、11,14,15-THETA（AUC=0.765）和吲哚乙醛（AUC=0.704）被确定为潜在生物标志物。血清中喹啉酸（AUC=0.889）、胍基乙酸（AUC=0.864）、L-脯氨酸（AUC=0.802）、L-丝氨酸（AUC=0.815）和N-棕榈酰苯丙氨酸（AUC=0.889）显示出优异的诊断价值。

讨论

本研究揭示了HPAI H5N1感染早期引发的显著代谢重组，特别是脂质代谢和氨基酸代谢通路的扰动。鞘氨醇和硫酸脑苷脂的上调表明病毒利用鞘脂代谢通路促进膜融合和内吞过程。色氨酸代谢通路中喹啉酸和吡哆醛5'-磷酸的变化与免疫调节和神经系统功能异常相关。11,14,15-THETA作为15-脂氧合酶通路产物，其上调反映了感染引发的缺氧状态。2,3-二磷酸甘油酸的增加进一步证实了组织缺氧导致的代偿性反应。氨基酸代谢的改变（如丝氨酸和脯氨酸）为病毒复制提供了必要的物质基础。这些发现不仅深化了对H5N1致病机制的理解，也为开发靶向代谢通路的干预策略提供了新方向。

结论

本研究首次系统揭示了HPAI H5N1感染鸡模型的代谢响应特征，鉴定出与病毒感染密切相关的关键代谢物和通路。肺组织作为主要靶器官显示出更显著的代谢扰动。鞘脂代谢和色氨酸代谢通路的激活为解释病毒入侵和中枢神经系统症状提供了代谢视角。所筛选的生物标志物群为未来疾病诊断和机制研究奠定了坚实基础。尽管目前缺乏鸡特异性代谢数据库，但本研究结果为构建鸟类代谢组学资源提供了重要数据支撑。