琼脂糖压印法：一种用于斑马鱼幼鱼固定化的简单可定制技术

本技术报告推荐一种新型斑马鱼幼鱼固定化技术——琼脂糖压印装置（ASD）。该方法通过3D打印模具在琼脂糖中压印出幼鱼形态的微腔阵列，实现快速、标准化固定，同时保留尾部、眼部或嘴部活动自由度。相比传统包埋法，ASD显著提高实验可重复性，支持高通量行为分析（如视动反应OKR、摄食行为检测），为神经行为学研究提供低成本、高灵活性的技术平台。

　　

引言

斑马鱼幼鱼因其遗传可操作性、体型微小和光学透明性，已成为神经科学和行为研究的重要模型。传统琼脂糖包埋法存在操作繁琐、定位不一致、长期固定易引发应激反应等问题。尽管微流体设备能实现精确定位，但其高昂成本和专业制备要求限制了广泛应用。本研究开发的琼脂糖压印装置（ASD）填补了简单包埋与高端微流体技术之间的空白，通过可定制的3D打印模具在琼脂糖中形成标准化幼鱼腔体，实现快速、可重复的幼鱼排列。

材料与方法

实验流程设计

ASD制备流程分为三个阶段：CAD设计阶段通过三维建模软件定制单幼鱼腔、多幼鱼阵列、微流通道等特征；模具制备阶段采用分辨率50μm的树脂3D打印机（Elegoo Mars 2 Pro）制作 stamp；设备成型阶段将熔融琼脂糖（1.5%-3%浓度）浇注至含模具的培养皿，固化后移除模具形成腔体。

生物学实验系统

使用7日龄野生型AB品系（ABWT）幼鱼和转基因品系SAIGFF213A;UAS:GCaMP6s（用于脊髓神经元钙成像）和Tg(AgRP1:ChR2-Kaede)（用于摄食行为研究）。所有实验遵循动物伦理规范（IACUC协议号24-115）。

行为学分析平台

采用定制Python视觉管道进行眼部追踪，通过阈值处理和椭圆拟合提取眼球运动参数。尾部运动分析使用开源软件ZebraZoom进行中线点标注和摆动角度计算。摄食行为通过粒子图像测速技术（PIV）量化 suction events。

定位精度量化

建立数学评估模型：通过眼球面积不对称性（ΔA_norm）评估轴向旋转，通过坐标偏移量（X_avg, Y_avg）评估平移动，引入NaN比率量化追踪失效帧，最终综合生成对齐评分（S_align）。

结果

工艺参数优化

琼脂糖浓度测试表明1.5%浓度在0.5-2mm特征尺寸上保持最佳成型精度（图2）。腔体几何学优化显示0.525mm头宽与0.5mm深度组合在90个样本测试中获得最高对齐评分（p<0.05），过窄腔体（0.325mm）导致过度约束，过宽（0.725mm）则稳定性下降（图3）。

行为自由度验证

自由尾部构型下，幼鱼在视动刺激中表现出规律的眼球转动（最大角度±20°）和尾部偏转（图4）。自由嘴部构型中，PIV分析成功捕捉到摄食产生的流体速度峰值（最高800μm/s），事件频率随实验时间递增（图5）。

高通量应用展示

8联阵列装置实现并行荧光筛选（图6），转基因个体通过GCaMP6s荧光标记识别。开放式设计使幼鱼回收存活率达95%，显著高于传统包埋法（约70%）。

讨论

技术优势分析

ASD技术通过标准化腔体设计消除传统包埋的位置变异，其对齐评分系统为固定质量提供量化标准。自由运动构型突破传统固定技术的行为限制，首次实现固定状态下眼-尾-嘴协同行为的同步记录。

应用场景拓展

该平台适用于长期行为监测（>30分钟OKR记录）、药物筛选（多幼虫并行处理）和发育研究（4-30dpf多尺寸适配）。与水浸物镜的兼容性（补充图1）为未来神经成像应用奠定基础。

成本效益比较

相比商业模具（数百美元/个）和微流控芯片（千美元级），ASD的单模成本可低至美分级别，桌面级3D打印（200-400美元设备）即可实现实验室自给自足。

结论

琼脂糖压印装置提供了一种兼顾标准化固定与自然行为保留的创新解决方案。其可定制设计、低成本特性和量化评估体系，为斑马鱼行为学研究建立新的技术标准，特别适用于需要高重复性、部分行为自由度保留和中通量筛选的实验场景。