泰国南部结核病患者外周血单个核细胞的功能与表型特征：揭示疾病状态特异性免疫反应与分枝杆菌生长控制新机制

本研究通过整合分枝杆菌生长抑制试验（MGIA）与流式细胞术，系统分析了泰国南部活动性结核病（ATB）、潜伏性结核感染（LTBI）及健康对照（HC）人群的外周血单个核细胞（PBMCs）免疫特征。研究发现ATB组表现出更强的分枝杆菌控制能力，且NK细胞频率、CD4+/CD8+ T细胞TNF-α产生与菌落控制呈负相关，为结核病诊断标志物发现和疫苗研发提供了关键功能学依据。

　　

引言

结核病（Tuberculosis, TB）作为由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, M.tb）引起的全球性公共卫生危机，其免疫反应机制因感染状态（活动性疾病ATB与潜伏感染LTBI）、宿主遗传背景、地理因素及疫苗史等呈现高度异质性。缺乏明确的免疫保护相关性（Correlates of Protection, CoP）和BCG疫苗在成人中保护效力的可变性，仍是结核病防控面临的核心挑战。本研究立足于泰国南部人群，通过功能性免疫学分析旨在揭示不同疾病阶段的免疫特征差异。

材料与方法

临床样本采集自60名≥18岁志愿者（20名ATB、20名LTBI、20名健康对照HC），最终纳入分析的样本量为ATB n=15、LTBI n=15、HC n=13（基于PBMC得率调整）。LTBI的界定依据包括高风险暴露史、结核菌素皮肤试验（TST）硬结≥10 mm或干扰素γ释放试验（IGRA）阳性。PBMCs通过肝素抗凝全血密度梯度离心分离，并经程序冷冻保存于液氮。

免疫表型分析采用流式细胞术。以纯化蛋白衍生物（PPD）刺激后，检测CD4⁺、CD8⁺ T细胞、CD56⁺ NK细胞及CD3⁺CD56⁺ NKT细胞的细胞因子反应（IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-17），并使用CytoFLEX S流式细胞仪获取数据。

分枝杆菌生长抑制试验（MGIA）以东京172-1株BCG（QSMI）作为菌株来源，通过BACTEC MGIT 960系统测定时间至阳性（Time to Positivity, TTP），并转换为Log₁₀CFU以量化细菌净生长。

统计分析使用Kruskal–Wallis检验及Spearman相关性分析，显著性设定为p ≤ 0.05。

结果

人群特征显示，ATB患者中位年龄较高（61.5岁），且所有参与者均曾有BCG接种史。

MGIA结果显示，ATB组对BCG生长的控制能力显著高于LTBI与HC组（p < 0.01），且在LTBI组中IGRA阳性与阴性个体间无差异。

流式细胞分析揭示，ATB组中NK细胞（CD3^-CD56⁺）频率显著高于LTBI（p < 0.05），而CD4⁺、CD8⁺ T细胞及NKT细胞比例无组间差异。

细胞因子方面，ATB组CD4⁺ T细胞的TNF-α反应显著高于HC，CD8⁺ T细胞中IL-2水平较低而TNF-α较高。NKT细胞中，LTBI组IFN-γ高于HC，而IL-17在HC与ATB中高于LTBI。

相关性分析表明，BCG净生长与CD4⁺ IL-4（rho = -0.4045, p = 0.0243）、CD4⁺ TNF-α（rho = -0.3991, p = 0.0434）及CD8⁺ TNF-α（rho = -0.4045, p = 0.0404）均呈显著负相关。

讨论

本研究在泰国南部人群中首次系统整合MGIA与多参数流式分析，发现ATB患者虽处于疾病状态，但其PBMCs在离体条件下反表现出更强的分枝杆菌控制能力，可能与持续抗原暴露引发的免疫激活或单核/巨噬细胞重编程有关。结果与部分欧美研究一致，但不同于南非及韩国报道，提示人群或方法学因素可能导致MGIA结果的差异。

NK细胞在ATB中频率升高，支持其在早期抗结核免疫中可能通过ADCC等机制发挥作用，尽管既往研究结果存在不一致。

TNF-α作为关键炎症因子，其由CD4⁺与CD8⁺ T细胞产生的能力与菌落控制显著相关，突出了该细胞因子在抗结核保护中的中心地位——这与TNF阻断治疗诱发结核再激活的临床现象相吻合。而IL-4与生长抑制的负相关则挑战了其传统“Th2有害”的范式，暗示其在特定语境下可能参与免疫调节。

本研究存在样本量有限、LTBI定义依赖IGRA/TST而非金标准、BCG作为M.tb替代物缺乏部分毒力因子等局限。未来需开展纵向研究及机制探索（如抗体中和或基因敲降）以验证这些细胞因子在保护中的作用。

结论

本研究强调了TNF-α+ T细胞反应在结核免疫控制中的核心作用，为未来疫苗设计应聚焦于激发多功能T细胞反应而非单一IFN-γ反应提供了理论依据。通过建立MGIA与免疫表型的关联，不仅为结核病功能性生物标志物的开发奠定基础，也为高负担地区的免疫学研究提供了可推广的技术路径。