M2型巨噬细胞纳米囊泡通过诱导M1向M2样极化调控坏死性小肠结肠炎后炎症反应

本综述系统阐述了M2型巨噬细胞纳米囊泡（M2NVs）通过重编程巨噬细胞极化状态（M1向M2转化）调控坏死性小肠结肠炎（NEC）炎症反应的作用机制。研究采用连续挤压技术制备高产量M2NVs，通过体内外实验证实其能显著降低促炎因子（IL-6、TNFα）表达并提升抗炎因子（IL-4、TGFβ）水平，同时代谢组学分析揭示其通过膜转运系统和消化系统通路改善肠道微环境，为NEC治疗提供了新型纳米生物治疗策略。

　　

引言

坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种严重的炎症性胃肠道疾病，主要影响体重低于1500g的早产儿，发病率达2%-13%。其临床特征表现为小肠和结肠的缺血性坏死，引发破坏性肠道炎症反应，常导致严重败血症和死亡。目前缺乏特异性有效治疗方法，主要依赖支持性护理，严重者需肠道手术，但幸存者仍面临短肠综合征、生长受限等严重后遗症。研究表明NEC发病机制与过度促炎反应和/或抗炎反应不足导致的免疫失调密切相关，其中巨噬细胞作为肠道免疫系统的关键组分，在早期调节和解决肠道炎症中起核心作用。

巨噬细胞传统上分为M1型（经典激活）和M2型（替代激活）两种极化表型。M1巨噬细胞由IFNγ等促炎细胞因子诱导产生，分泌IL-6、TNFα等促炎因子；M2巨噬细胞则响应IL-4等2型炎症细胞因子，发挥抗炎作用和组织修复功能。近年研究发现，单纯增加M2巨噬细胞比例或重编程M1向M2转化并非可行治疗策略，可能加剧纤维化反应。因此，开发有效调控巨噬细胞极化的新策略成为NEC治疗的重要方向。

材料与方法

研究采用RAW264.7小鼠单核巨噬细胞系，通过LPS（100 ng/mL）诱导M1极化，IL-4（20 ng/mL）诱导M2极化。M2NVs制备采用连续挤压系统：收集1×10⁶巨噬细胞，重悬于PBS后通过系列聚碳酸酯膜过滤器（孔径1.0 μm、400 nm、200 nm）挤压，最后通过离心纯化获得M2NVs。通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电镜（TEM）表征囊泡粒径分布和形态特征。

建立NEC动物模型：3日龄SD大鼠通过高渗配方奶喂养（每4小时一次），结合冷应激（4°C，10分钟）和缺氧条件（5% O₂，95% N₂，每日3次），同时每日灌服LPS（200μl，100 ng/mL）。M2NVs干预组每日腹腔注射M2NVs（300μl，10⁶/mL）。通过Western blot、流式细胞术、ELISA、免疫荧光和HE染色等技术分析细胞表型和炎症因子表达。肠道代谢组学分析采用UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS系统，通过PCA分析和KEGG通路富集解析代谢变化。

结果

3.1 M1和M2巨噬细胞的极化与鉴定

RAW264.7细胞在LPS诱导后呈现不规则多边形纺锤形态，高表达M1标志物CD86（88.41%）；IL-4诱导的M2细胞则保持小而圆的形态，高表达CD206（85.06%）。Western blot证实LPS组CD86表达升高3.46倍（p<0.01），IL-4组CD206表达升高1.78倍（p<0.01）。ELISA检测显示LPS组促炎因子IL-6、TNFα显著上调，IL-4组抗炎因子IL-4、TGFβ明显升高。免疫荧光结果进一步验证TNFα在LPS组高表达，TGFβ在IL-4组显著提升。

3.2 M2NVs的制备、表型鉴定及重极化效应

NTA分析显示M2NVs平均粒径为149.5 nm，浓度达2.5×10⁶/mL，粒径分布均匀（89.8%）。TEM观察显示囊泡呈规则圆形，具有完整球形膜结构，粒径范围100-150nm。将M2NVs与LPS诱导的M1巨噬细胞共培养后，流式细胞术和Western blot显示CD86表达显著降低，CD206表达明显上调（p<0.01）。ELISA检测表明M2NVs干预后促炎因子（IL-6、TNFα）表达下降，抗炎因子（IL-4、TGFβ）表达升高。免疫荧光显示TNFα信号减弱，TGFβ信号增强。

3.3 M2NVs治疗减轻NEC炎症反应和损伤

体内实验显示NEC组大鼠肠道组织呈黑红色，肠管脆弱伴局部扩张；M2NVs治疗组肠道颜色接近正常，仅局部 discoloration。HE染色显示NEC组绒毛上皮细胞紊乱伴粘膜下水肿和局部绒毛脱落，治疗组这些病理改变明显改善。Western blot分析表明M2NVs干预使CD86表达降低42.5%（p<0.01），CD206表达提升4.34倍（p<0.01）。免疫荧光和ELISA结果一致显示TNFα表达下降，TGFβ表达上升，促炎因子水平降低，抗炎因子水平提高。

3.4 M2NVs治疗后肠道微环境代谢物变化

代谢组学分析发现NEC组与对照组存在423种差异表达代谢物（P<0.05）。KEGG通路富集分析显示膜转运系统和消化系统在NEC肠道微环境变化中起重要作用。M2NVs干预后，差异代谢物分析发现16-羟基-10-氧代十六烷酸、N-乙酰神经氨酸、1-甲基-4-[(4-甲基苯基)氨基]-3-硝基氢喹啉-2-酮、长春新碱等代谢物存在显著差异（p<0.01），表明M2NVs不仅具有抗炎作用，还参与NEC肠道环境代谢调控。

讨论

本研究成功建立连续挤压法制备M2NVs的技术体系，证实其能有效促进M1向M2巨噬细胞转化，改善NEC诱导的肠道损伤和炎症反应。巨噬细胞极化状态在NEC进程中起决定性作用，M2NVs通过调控极化平衡增强吞噬和杀菌能力，提高抗感染能力。代谢组学分析揭示M2NVs干预通过影响膜转运和消化系统通路改变肠道代谢环境，为寻找NEC生物标志物提供新思路。

研究局限性包括缺乏更详细的代谢物筛查，不同级别肠道损伤和营养输送对代谢物差异表达的影响尚未完全阐明。未来需评估不同NEC严重程度下的代谢物变化，探索炎症水平与NEC之间的通路联系，明确M2NVs干预与代谢变化关联的因果关系。

结论

研究开发了具有高产量和增强抗炎特性的M2NVs仿生囊泡制备技术。体内外实验证实M2NVs通过促使M1巨噬细胞向M2表型极化，在NEC诱导的肠道损伤和炎症中发挥积极作用。设计的M2NVs具有良好生物学特性和炎症调节功能，通过调控巨噬细胞极化实现类似M2巨噬细胞的NEC治疗效果。该工程化策略具有三大优势：机械化生产可复制巨噬细胞原始功能且产量优于外泌体；代谢组学分析揭示其综合生物学功能；临床应用前景广阔（无毒、生物相容性好、制备简便、结构类似外泌体）。M2NVs作为有潜力的外泌体替代品，为NEC治疗提供创新性纳米治疗策略。